神経系特異的RNA結合蛋白質Mouse-Musashiの標的配列認識機構

神经系统特异性RNA结合蛋白靶序列识别机制 Mouse-Musashi

• 批准号: 07268101
• 负责人: 岡野 栄之
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07268101/
• 关键词: mouse-Musashi-1; RNA結合蛋白質; RNA認識モチーフ; RNA結合能; Northwesternブロット; CDスペクトル; 一次元NMR; 2次元^1H-^<15>N HSQC

本研究においては、哺乳類中枢神経系の幹細胞に強く発現しているRNA結合蛋白質であるmouse-Musashi-1(m-Msi-1)のRNA結合能について検討し、m-Msi-1蛋白質について構造生物学的解析を行うことを目的とする。m-Msi-1蛋白質は、2つのRNA認識モチーフ(RRM;RNA Recognition Motif)を有し、それぞれ、N末側よりMMA,MMBと名付けている。Northwesternブロット法により、MMA,MMB蛋白質それぞれのRNA結合能について検討したところ、MMAのみがRNA結合能を有することが明らかとなった。本年度は、以下のようにMMA蛋白質の大腸菌からの精製方法の改良した。即ち、懸濁条件をTriHClpH9.0からリン酸ナトリウム緩衝液PH6.0へ変更することにより、全てのMMAの可溶化に成功核酸の共存硫安塩析と陰イオン交換クロマトグラフィーを前操作に加えることにより、全ての核酸の除去に成功した。さらに、以下のような構造生物学的な解析を行った。(MMAおよびMMBタンパク質のCDスペクトル)MMAとMMBのCDスペクトルパターンは大きく異なっている。個々のドメインのRNA結合能とCDスペクトル、U1Aの2つのドメインのRNA結合能とCDスペクトルと酷似する。しかし、U1Aの論文中に記載されているC末端のRBDがRNAに結合しない理由がm-Msi-1の場合には当てはまらないことから、m-Msi-1ではU1Aとはべつの機構によりRNA認識または結合性が決められている可能性がある(またはU1Aの考察が違っているかもしれない)。(MMAの一次元NMRの測定)約1.5mMのMMAを20度で一次元NMR測定した。8-10ppm付近にαヘリックス等の二次構造により溶媒と交換しない主鎖のアミドプロトンやトリプトファンの側鎖のアミノプロトンのシグナルが強く検出されていることとβシートを構成するアミノ酸のαプロトンに特徴的な低磁場シフトしたシグナルが5-6ppm付近に見られることから、αヘリックスやβシートなどの二次構造を形成していることがわかった。(MMAの^<15>N安定同位体標識の成功と2次元^1H-^<15>N HSQCの測定)0.4%[^<15>N]NH4Clと0.2%D-glucoseを含むM9培地でMMAタンパク質を発現させて、^<15>NラベルされたMMAタンパク質を得ることに成功した。これを濃縮し2次元^1H^<15>N HSQCを測定した。その結果、^1Hの化学シフトが6-10.5ppm、^<15>Nの化学シフトが100-132ppmの範囲でピークが全体的に分散しシャープであることからMMAが、構造を形成していることがわかった。また、得られてピークが充分に分散しており、ピークの数がMMAの主鎖のアミド結合(84個)と側鎖のアミノ基(10×2=20個)の数を足したものとほぼ対応したのでMMAが均一に^<15>N標識されていることが確認できた。これらのことはこれまで解析が行われているRBDのなかでも(U1A,hnRNPD等)、構造解析がし易いサンプルであることがわかった。

This study に お い て は, mammalian central god 経 の strong stem cells に く 発 now し て い る rna-binding protein で あ る mouse - Musashi - 1 (m - Msi - 1) の RNA binding energy に つ い て beg し 検, m - Msi - 1 protein に つ い て structural biology of analytical line を う こ と を purpose と す る. M - protein は Msi - 1, 2, つ の RNA known モ チ ー フ (RRM; RNA Recognition Motif) を し, そ れ ぞ れ, at the end of the N side よ り MMA, MMB と name pay け て い る. Method of Northwestern ブ ロ ッ ト に よ り, MMA, MMB protein そ れ ぞ れ の RNA binding energy に つ い て beg し 検 た と こ ろ, MMA の み が RNA binding energy を have す る こ と が Ming ら か と な っ た. This year, <s:1> and the following <s:1> ようにMMA protein <s:1> escherichia coli ら <s:1> refining method <e:1> have been improved by <s:1> た. Namely ち, clouding condition を TriHClpH9.0 か ら リ ン acid ナ ト リ ウ ム buffer PH6.0 へ - more す る こ と に よ り, whole て の MMA の solubilization に successful nucleic acid の coexistence sulfur Ann salt analysis と Yin イ オ ン exchange ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を に before operation and え る こ と に よ り, whole て の の nucleic acid to remove に success し た. Youdaoplaceholder0. The following is the な analysis of ような structural biology を line った. (MMA お よ び MMB タ ン パ ク qualitative の CD ス ペ ク ト ル) MMA と MMB の CD ス ペ ク ト ル パ タ ー ン は big き く different な っ て い る. A 々 の ド メ イ ン の RNA binding energy と CD ス ペ ク ト ル, U1A の 2 つ の ド メ イ ン の RNA binding energy と CD ス ペ ク ト ル と resembles す る. し か し, U1A の paper recorded に さ れ て い る C terminal の RBD が RNA に combining し な い reason が の m - Msi - 1 occasion に は when て は ま ら な い こ と か ら, m - Msi - 1 で は U1A と は べ つ の institutions に よ り RNA known ま た は associativity が definitely め ら れ て い る possibility が あ る (ま た は U1A の Youdaoplaceholder0 is in violation of って る る れな れな. (MMA <s:1> primary NMR <e:1> determination) approximately 1.5mM <s:1> MMAを20 degrees で primary NMR determination た た. Pay nearly 8-10 PPM に alpha ヘ リ ッ ク ス の such as secondary tectonic に よ り solvent exchange し と な い master lock の ア ミ ド プ ロ ト ン や ト リ プ ト フ ァ ン の side chain の ア ミ ノ プ ロ ト ン の シ グ ナ ル が strong く 検 out さ れ て い る こ と と beta シ ー ト を constitute す る ア ミ ノ acid の alpha プ ロ ト ン に な low magnetic field of 徴 シ フ ト し た シ グ ナ ル が 5-6 PPM paying nearly に see ら れ る こ と か ら, alpha ヘ リ ッ ク ス や beta シ ー ト な ど の formation し secondary tectonic を て い る こ と が わ か っ た. (MMA <s:1> ^<15>N stable isosteric identifier と successful と 2d ^1H-^<15>N HSQC の determination) 0.4% [^ < 15 > N] NH4Cl と 0.2% D - glucose を containing む M9 petty で MMA タ ン パ ク qualitative を 発 now さ せ て, ^ < 15 > N ラ ベ ル さ れ た MMA タ ン パ ク qualitative を must る こ と に successful し た. <s:1> れを concentrate <s:1> 2d ^1H^<15>N HSQCを determine <s:1> た. そ の results, ^ 1 h chemical シ の フ ト が 6-10.5 PPM, ^ < 15 > N の chemical シ フ ト が 100-132 PPM の van 囲 で ピ ー ク が all に scattered し シ ャ ー プ で あ る こ と か ら MMA が, tectonic を form し て い る こ と が わ か っ た. ま た, ら れ て ピ ー ク が に adequately dispersed し て お り, ピ ー ク の number が MMA の master lock の ア ミ ド combination (84) と side chain の ア ミ ノ base (10 x 2 = 20) の number を foot し た も の と ほ ぼ 応 seaborne し た の で MMA が uniform に ^ < 15 > N logo さ れ て い る こ と が confirm で き た. こ れ ら の こ と は こ れ ま で parsing line が わ れ て い る RBD の な か で も (U1A, hnRNPD, etc.), structure が し easy い サ ン プ ル で あ る こ と が わ か っ た.

项目成果

Matsumoto, M., Okano, H., et al.: "Ataxia and epileptic seizures in mice lacking type 1 inositol 1, 4, 5-trisphophate receptor" Nature. 379. 168-171 (1996)

Matsumoto, M.、Okano, H. 等人：“缺乏 1 型肌醇 1,4,5-三磷酸盐受体的小鼠中的共济失调和癫痫发作”《Nature》。

Okabe, M., Okano, H. et al.: "Instinsic and extrinsic determinants regulating cell fate decision in developing nervous system." Dev. Neurosci.(in press). (1996)

Okabe, M., Okano, H. 等人：“调节神经系统发育中细胞命运决定的内在和外在决定因素。”

Mikoshiba, K., Okano, H. et al.: "Progress in Brain Research" Elsevier. Eds. Yu, A. C. H., Eng, L. F., Mahan, U. J., Schulman. H., Shooter, E. and Stadin, A., 18 (1995)

Mikoshiba, K.、Okano, H. 等人：“大脑研究进展”Elsevier。

Sawamoto, K., Okano, H. et al.: "Argos is required for optic lobe development and projection of photoreceptor axons." Developmental Dynamics. 205. 162-171 (1996)

Sawamoto, K.、Okano, H. 等人：“Argos 是视叶发育和光感受器轴突投射所必需的。”

Okano, H. et al.: "Basic Neuroscience in Invertebrate" Business Center for Academic Societies Japan, Ed. H. Koike, 19 (1996)

Okano, H. 等人：“无脊椎动物的基础神经科学”日本学术团体商业中心，编辑。