高等植物原形質膜G蛋白質の構造、機能と器官特異性の解析

イネG蛋白質αサブユニットの機能解析・原形質膜局在化の同定イネG蛋白質αサブユニット融合蛋白質の精製と機能解析:ヒスチジンヘキサマーのタグを有するpQE30ベクター(QIAGEN)を用いて、大腸菌にイネG蛋白質αサブユニット(RGA1)融合蛋白質を発現させ、46kDaの見かけの分子量を示す産物を精製した。精製産物は、[35S]GTPγS結合能、GTPase活性を、共に有していた。この結果は、動物のホモログとして単離され、塩基配列の類似性から推察していたイネ3量体G蛋白質αサブユニットcDNA(RGA1)の翻訳産物が、GTP結合能、および加水分解能を有することを示した。特異抗体の調製:イネG蛋白質αサブユニットに対する融合蛋白質を、マウスに免疫した後、2種のモノクローナル抗体(A5-D11、B2-C1)を作製した。イネG蛋白質αサブユニットの細胞内局在性:暗所下で育てた黄色葉から、おのおの、ミトコンドリア、粗ミクロソーム、および水性2相分配法にて原形質膜の調製した後、上記の2種類のモノクローナル抗体を用いてWestern blottingにて解析した。両抗体は、原形質膜画分の45kDa蛋白質と特異的に反応した。次に電気泳動にて、上記の45kDa蛋白質領域を切りだし、V8プロテアーゼによるペプチドマップを行い、Western blottingにて切断パターンを解析したところ、イネG蛋白質αサブユニット(RGA1)融合蛋白質のペプチドマップのそれと一致した。以上のことから、RGA1の翻訳産物は、原形質膜画分に局在する45kDa蛋白質であると判断した。

イネG蛋白質αサブユニットの機能解析・原形質膜局在化の同定イネG蛋白質αサブユニット融合蛋白質の精製と機能解析:ヒスチジンヘキサマーのタグを有するpQE30ベクター(QIAGEN)を用いて、大腸菌にイネG蛋白質αサブユニット(RGA1)融合蛋白質を発現させ、46kDaの見かけの分子量を示す産物を精製した。精製産物は、[35S]GTPγS結合能、GTPase活性を、共に有していた。この結果は、動物のホモログとして単離され、塩基配列の類似性から推察していたイネ3量体G蛋白質αサブユニットcDNA(RGA1)の翻訳産物が、GTP結合能、および加水分解能を有することを示した。特異抗体の調製:イネG蛋白質αサブユニットに対する融合蛋白質を、マウスに免疫した後、2種のモノクローナル抗体(A5-D11、B2-C1)を作製した。イネG蛋白質αサブユニットの細胞内局在性:暗所下で育てた黄色葉から、おのおの、ミトコンドリア、粗ミクロソーム、および水性2相分配法にて原形質膜の調製した後、上記の2種類のモノクローナル抗体を用いてWestern blottingにて解析した。両抗体は、原形質膜画分の45kDa蛋白質と特異的に反応した。次に電気泳動にて、上記の45kDa蛋白質領域を切りだし、V8プロテアーゼによるペプチドマップを行い、Western blottingにて切断パターンを解析したところ、イネG蛋白質αサブユニット(RGA1)融合蛋白質のペプチドマップのそれと一致した。以上のことから、RGA1の翻訳産物は、原形質膜画分に局在する45kDa蛋白質であると判断した。