骨肉腫細胞における導入p53遺伝子による放射線感受性支配の分子機構

ヒト由来骨肉腫細胞(SAOS-2)p53cDNAを組み込んだ発現プラスミド(pMSVeneop53)をトランスフェクションし、G418にて選択し,比較的増殖の遅い60個のクローンを選んだ。これらのクローンからRANおよびタンパクを抽出し、p53遺伝子の発現について、ノーザンおよびウエスタンブロットを用いて検索し、さらにPT-PCRを行った結果、正常分子量のp53タンパクを発現しているクローン(SAOS-MC11)、C未満欠失と思うわれる分子量48kDaタンパクを発現しているクローン(SAOS-MC43)およびN末端欠失と思われるp53mRAMの発現はみられるがタンパク産生を行っていないクローン(SAOS-MC10)が得られた。p53遺伝子の導入により得られた3つのクローンと親株(SAOS-2)およびベクター導入株(SAOS-MSV)の放射線感受性を比較した場合、SAOS-MC11は親株やベクター導入株に比べて著しく放射線に感受性となり、SAOS-MC43は放射線抵抗性となった。また、SAOS-MC10については有意な放射線感受性の変化は認められなかった。フローサイトメトリーにより親株、ベクター導入株および3つのp53遺伝子導入クローンに関してフローサイトメトリーにより指数的増殖期における細胞周期分布を調べたところ、細胞株間における有意な差はみられなった。次に、放射線照射後の細胞周期分布について解析した。5Gy照射後20時間におけるDNAヒストグラムの結果、全てのクローンにおいてG2ブロックは共に見られたが、クローンSAOS-MC11も含めて放射線照射後の明確なGIブロックが欠けていた。しかし、SAOS-MC11細胞においては、放射線照射後に、DNAのマイクロフラクションが増大していた。このことは部分的なアポトーシスが起きていることを示唆している。

ヒト由来骨肉腫細胞(SAOS-2)p53cDNAを組み込んだ発現プラスミド(pMSVeneop53)をトランスフェクションし、G418にて選択し,比較的増殖の遅い60個のクローンを選んだ。これらのクローンからRANおよびタンパクを抽出し、p53遺伝子の発現について、ノーザンおよびウエスタンブロットを用いて検索し、さらにPT-PCRを行った結果、正常分子量のp53タンパクを発現しているクローン(SAOS-MC11)、C未満欠失と思うわれる分子量48kDaタンパクを発現しているクローン(SAOS-MC43)およびN末端欠失と思われるp53mRAMの発現はみられるがタンパク産生を行っていないクローン(SAOS-MC10)が得られた。p53遺伝子の導入により得られた3つのクローンと親株(SAOS-2)およびベクター導入株(SAOS-MSV)の放射線感受性を比較した場合、SAOS-MC11は親株やベクター導入株に比べて著しく放射線に感受性となり、SAOS-MC43は放射線抵抗性となった。また、SAOS-MC10については有意な放射線感受性の変化は認められなかった。フローサイトメトリーにより親株、ベクター導入株および3つのp53遺伝子導入クローンに関してフローサイトメトリーにより指数的増殖期における細胞周期分布を調べたところ、細胞株間における有意な差はみられなった。次に、放射線照射後の細胞周期分布について解析した。5Gy照射後20時間におけるDNAヒストグラムの結果、全てのクローンにおいてG2ブロックは共に見られたが、クローンSAOS-MC11も含めて放射線照射後の明確なGIブロックが欠けていた。しかし、SAOS-MC11細胞においては、放射線照射後に、DNAのマイクロフラクションが増大していた。このことは部分的なアポトーシスが起きていることを示唆している。