中枢ニューロンへの受容体サブユニット遺伝子の導入

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中枢ニューロンへの受容体サブユニット遺伝子の導入する目的で、AMPA型グルタミン酸受容体サブユニット遺伝子をコードするアデノウイルスベクターを作成した。Heinemannから譲り受けたGluR2 flipを外来遺伝子として持つプラスミド(pBluescript SK(-))を一本鎖調製用の大腸菌(DH11S)に形質転換し、ヘルパーファージ(M13KO7)を感染させ、(-)鎖のGluR2 flip phagemidを調製した。このphagemidの一本鎖DNAを鋳型にEckstein法により、GluR2 flipの2175番目塩基のグアニン(G)をシトシン(C)に変える点変異導入を行った。この点変異導入によってアミノ酸配列は変わらない(CTG=L CTC=L)が、制限酵素XhoIによる切断部位(CTCGAG)が導入されたため、内在性の天然型GluR2 flipと区別することができる。核酸配列のシークエンシングにより点変異が正しく導入されていることを確かめた後、RNAをin vitro合成しアフリカツメガエル卵母細胞に受容体タンパクを発現させ、電気生理学的に天然型のGluR2 flipタンパクが合成されていることを確かめた。こののプラスミドGluR2 (XhoI)のSmaI部位からEco RV部位までの3.2kbを切り出し、末端平滑化の後、斎藤泉の開発されたコスミドカセットpAdexCAのSwaI部位に挿入した。pAdexCA(44.8kb)は、アデノウイルス5型遺伝子のほぼ全配列(33.3kb)を含み、宮崎純一の開発されたCAGプロモーターを持つ。このコスミドpAdexCA-GluR2(XhoI)と、制限酵素EcoT221処理した5型アデノウイルスをヒト腎由来のHEK293細胞中で相同組み換えを起こさせ、組み替えアデノウイルスAdexGluR2-XhoIを得た。さらに、AdexGluR2-XhoIを神経系の細胞株(PC12)に感染させたところ、PC12においてGluR2-XhoI RNAが合成されていることを逆転写-遺伝子増幅(RT-PCR)法により確かめた。