組織特異的遺伝子破壊法によるGPIアンカー型蛋白の機能解析

使用组织特异性基因破坏方法对 GPI 锚定蛋白进行功能分析

• 批准号: 08252205
• 负责人: 竹田 潤二
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08252205/
• 关键词: GPIアンカー型蛋白; Tリンパ球; Pig-a; コンディショナルジーンターゲッティング; Cre; loxP; ケラチン5

遺伝子破壊マウスの実験結果はGPI-アンカー欠損は致死性であり、組織特異的に遺伝子破壊ができるCre/loxPを利用し、種々の器官形成あるいは特定の細胞におけるGPIアンカー型蛋白の役割を検索した。1)GPIアンカー欠損個体の解析Pig-aはGPI-アンカー生合成に必須の遺伝子であり、X染色体上に存在する。Pig-1欠損キメラマウスのキメリズムが高くならないことより、GPI-アンカー欠損個体は致死性であることが想像された。致死性を解除する目的でPig-a遺伝子にloxP部位を導入したマウスを作成した(Piga-loxP)。キメラマウスの解析では発生のどの段階での致死かがわからなかったので、発生初期よりCreが発現するhCMV-CreマウスとPiga-loxPマウスを交配し、致死の時期、状態を検討した。Pig-a遺伝子が完全に欠損した雄(XY)個体は、胎生9日で観察したところ個体発生が停止していた。片方のアリルでPig-a遺伝子が破壊されるような雌(XX)個体では、頭部神経管閉鎖不全、口蓋裂が観察された。2)Tリンパ球におけるGPIアンカー型蛋白の役割の検討未熟Tリンパ球で発現誘導が可能なLckプロモーター下流にCreを連結したトランスジェニックマウスを作成した(Lck-Cre)。Piga-loxPとLck-Creマウスを交配した。そのマウスを解析するとTリンパ球特異的にGPIアンカー型蛋白の発現がほぼ完全に消失していた。3)皮膚表皮におけるGPIアンカー型蛋白の役割の検討ケラチンK5プロモーターは表皮基底細胞特異的な発現を規定する。そのプロモーター領域15kbをクローニングし、その下流にCreを連結させた後、トランスジェニックマウスを作成した(K5-Cre)。Piga-loxPとK5-Creマウスを交配した。そのマウスは表皮特異的にPig-a遺伝子が破壊されていた。組織標本を観察すると、Pig-a遺伝子が破壊されたマウスで角化異常が認められた。

Heritage 伝 son broken 壊 マ ウ ス の be 験 results は GPI - ア ン カ ー owe loss は deadly で あ り, tissue specific に heritage 伝 son broken 壊 が で き る Cre/loxP を USES し, kind of 々 の organ formation あ る い は specific の cells に お け る GPI ア ン カ ー cut type protein の service を 検 cable し た. 1) GPI ア ン カ ー owe damage of individual の parsing Pig - a GPI - ア は ン カ ー biosynthesis に must の heritage 伝 son で あ り, X chromosome に exist す る. Pig - 1 owe loss キ メ ラ マ ウ ス の キ メ リ ズ ム が high く な ら な い こ と よ り, GPI - ア ン カ ー owe damage of individual は deadly で あ る こ と が imagine さ れ た. Deadly を remove す る purpose で Pig - a legacy 伝 son に を loxP parts import し た マ ウ ス を made し た (Piga - loxP). キ メ ラ マ ウ ス の parsing で は 発 raw の ど の Duan Jie で の death か が わ か ら な か っ た の で, 発 born early よ り Cre が 発 now す る hCMV - Cre マ ウ ス と Piga - loxP マ ウ ス を し mating, lethal の period, state を beg し 検 た. Pig - a legacy 伝 が completely に owe loss し た male (XY) 9 individual は, viviparous で 観 examine し た と こ ろ individuals born 発 が stop し て い た. Piece of party の ア リ ル で Pig - a legacy 伝 son が broken 壊 さ れ る よ う な female (XX) individual で は insufficiency, head god 経 tube, flap が 観 examine さ れ た. 2) T リ ン パ ball に お け る GPI ア ン カ ー cut type protein の service の beg unripe 検 T リ ン パ ball で 発 induced が may now な Lck プ ロ モ ー タ ー obscene に Cre を link し た ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス を made し た (Lck - Cre). Piga-loxPとLck-Cre ウスを ウスを mating た た. Analytical す そ の マ ウ ス を る と T リ ン パ ball specific に GPI ア ン カ ー type protein の 発 now が ほ ぼ に disappear completely し て い た. 3) the skin epidermis に お け る GPI ア ン カ ー cut type protein の service の beg ケ 検 ラ チ ン K5 プ ロ モ ー タ ー は epidermal basal cell specific な 発 を regulations now す る. そ の プ ロ モ ー タ ー field 15 KB を ク ロ ー ニ ン グ し, そ の obscene に Cre を link さ せ た, ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス を made し た (K5 - Cre). Piga-loxPとK5-Cre ウスを ウスを mating た た. The skin specific にPig-a remnant 伝 が breaks 壊されて た た た. Tissue specimens を観 examination すると, Pig-a remains 伝 が rupture 壊された ウスで ウスで abnormal keratinization が identification められた.

项目成果

Minoru Takahashiet al.: "PIG-B,a membrane protein of the endoplasmic reticulum with a large lumenal domain,is involved in transferring the third mannose of the GPI anchor." The EMBO Journal. 15・16. 4254-4261 (1996)

Minoru Takahashiet al.：“PIG-B 是一种具有大腔域的内质网膜蛋白，参与 GPI 锚定的第三个甘露糖的转移。” EMBO 杂志 15・16。

Ohishi,K.: "Cloning and characterization of the murine GPI anchor synthesis gene Pigf,a homologue of the human PIGF gene." Genomics. 34. 340-346 (1996)

Ohishi,K.：“小鼠 GPI 锚定合成基因 Pigf（人类 PIGF 基因的同源物）的克隆和表征。”

Reika Watanabe et al.: "PIG-A and PIG-H,which participate in glycosyl phosphatidyl-inositol anchor biosynthesis,form a protein complex in the endoplasmic reticulum." Journal of Biological Chemistry. 271・43. 26868-26875 (1996)

Reika Watanabe 等人：“参与糖基磷脂酰肌醇锚生物合成的 PIG-A 和 PIG-H 在内质网中形成蛋白质复合物。”Journal of Biological Chemistry 271·43 (1996)。

Norimitsu Inoue et al.: "PIG-C,one of the three human genes involved in the first step of glycosylphospha-tidylinositol biosynthesis is a homologue of Saccharomyces cerevisiae GPI2." Biochemical and Biophysical Research Communications. 226. 193-199 (1996)

Norimitsu Inoue 等人：“PIG-C 是参与糖基磷脂酰肌醇生物合成第一步的三个人类基因之一，是酿酒酵母 GPI2 的同源物。”