神経系特異的RNA結合蛋白質Mouse-Musashiの標的配列認識機構

神经系统特异性RNA结合蛋白靶序列识别机制 Mouse-Musashi

• 批准号: 08260101
• 负责人: 岡野 栄之
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08260101/
• 关键词: mouse-Musashi-1蛋白質; NMR; HSQC; NOESY; TOCSY; COSY; 構造生物学; Northwesternブロット

本研究は、哺乳類神経系に強く発現しているmouse-Musashi-1(以下、m-Msi-1)蛋白質の機能解析並びに構造生物学的解析を行うものである。m-Msi-1蛋白質は、N-末から、RNA結合ドメイン(2つタンデムのRRM;MotifA(アミノ酸番号21-100)、MotifB(110-189)を有する。<構造生物学的解析>MMA 昨年までに確立したMMAタンパク質の大腸菌による大量発現系および精製系を使って、^<15>Nラベルの塩化アンモニウムを唯一の窒素源とするM9培地でMMAを発現させMMAの精製を行った。ここで得られた^<15>N標識MMAを使って2次元HSQCを測定したところ、充分な数のシグナルが適度に分散していたので構造解析に適したサンプルであることが確認された。しかし、非標識SB培地で培養したときに比べ発現量の顕著な低下が見られたので、発現方法並びに精製方法の改良を行っている。一方、非標識MMAの大量調製を行ったところSB培地中で大腸菌1L培養から9mgのMMAの精製に成功した。さらにこれを2mMまで濃縮し、1次元、2次元(NOESY、TOCSY、COSY)NMRの測定を行った。その結果、いずれのチャートからも良好なスペクトルを得られた。目下、これらのチャートを使ってアミノ酸残基のスピン系及び主鎖の連鎖帰属を行っているところである。<in vitroにおける機能解析>^★Northwesternブロット法により、MMA,MMB蛋白質でそれぞれのRNA結合能力について検討したところ、MMAのみがRNA結合能を有することが明らかとなった。^★ランダムな50merに相当するRNA分子をin vitro転写反応により調製し、m-Msi-1蛋白質のRNA結合ドメイン可溶性蛋白質との結合能を指標にm-Msi-1蛋白質が結合するRNA配列を同定し(in vitro selection法)、本蛋白質が、(G/A)U_nAGUというコンセンサス配列を持ったRNAと結合することを明らかにした。現在、ゲルシフト法により、結合解離定数を求めている。また、このコンセンサス配列を持ち、哺乳類神経幹細胞で発現している遺伝子の転写産物が、in vivoで本蛋白質と結合するかどうかについて免疫沈降反応とRT-PCRを組み合わせた方法により検討している。

This study is aimed at elucidating the function of mouse-Musashi-1(hereinafter m-Msi-1) protein and its structural biology in mammalian nervous system. m-Msi-1 protein, N-terminal, RNA-binding RRM (2);MotifA(21-100), MotifB(110-189). &lt;Analysis of Tectonic Biology&gt;MMA was established last year as the only source of <15>MMA produced by Escherichia coli and purified by M9 culture. This <15>is the first time that a two-dimensional HSQC has been determined. The culture of unlabeled SB was improved by comparing the yield and the method of discovery. A large amount of MMA was prepared in a square and non-labeled way. The culture of Escherichia coli in SB culture was successful in the purification of MMA in 9mg. 2mM concentration, 1D, 2D (NOESY, TOCSY, COSY)NMR measurements were performed. The results of the survey were as follows: In the present case, the chain of amino acid residues and the chain of amino acid residues in the chain of amino acid residues are changed. &lt;in vitro function analysis&gt;^★Northwestern method for RNA binding ability of MMA, MMA,MMB proteins ^^ RNA molecules corresponding to 50mer in vitro are modulated, RNA binding to m-Msi-1 protein is determined, soluble protein binding energy is determined, RNA alignment to m-Msi-1 protein binding is determined (in vitro selection method), this protein is determined,(G/A)U_nAGU is determined, RNA binding to m-Msi-1 protein is determined. Now, the combination of the two methods is determined. In addition, this protein can be expressed in mammalian stem cells, and the protein can be combined with RT-PCR.

项目成果

Okano,H.,et al.: "Basic Neuroscience in Invertebrate" Ed.H.Koike,Y.Kidokoro,K.Takahashi and T.Kanasei Japan Scientific Societies Press, 61-80 (1996)

Okano,H.,et al.：“无脊椎动物的基础神经科学”Ed.H.Koike、Y.Kidokoro、K.Takahashi 和 T.Kanasei 日本科学会出版社，61-80 (1996)

Muto,A.,Okano,H.et al: "Calcium wave and oscillation during cleavage stage of Xenopus laevise embryo and its inhibition by Heparin." J.Cell Biol.135. 181-190 (1996)

Muto,A.,Okano,H.等人：“爪蟾胚胎卵裂阶段的钙波和振荡及其肝素的抑制。”

Kume,S.,Okano,H.et al.: "Developmental expression of Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor and structural changes in the endoplasmic reticulum during oogenesis and meiotic maturation of Xenopus laevis." Developmental Biology. (印刷中). (1997)

Kume, S., Okano, H. 等人：“爪蟾卵子发生和减数分裂成熟过程中肌醇 1,4,5-三磷酸受体的发育表达和内质网的结构变化（正在出版）。” (1997)

Okabe,M.and Okano,H.: "Two-step induction of chordotonal organ preccursors in Drosophila embryogenesis." Development. 1045-1053 (1997)

Okabe,M. 和 Okano,H.：“果蝇胚胎发生中脊索器官前体的两步诱导”。

Sakakibara,S.,Okano,H.et al.: "Mouse-Musashi-1,a Neural RNA-Binding Protein Highly Enriched in the Mammalian CNS Stem Cell." Developmental Biology. 176. 230-242 (1996)

Sakakibara,S.,Okano,H.等人：“Mouse-Musashi-1，一种在哺乳动物 CNS 干细胞中高度富集的神经 RNA 结合蛋白。”