内向き整流性K^+チャネルと機能相関する膵B細胞蛋白のクローニング

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内向き整流性K^+チャネルのヒトROMK1のN端結合蛋白を同定するために、N端76残基をプローブとして、Two-hybrid systemを用いてKidney cDNA libraryをスクリーニングした。その結果、9個の陽性クローンを検出した。そのうち、7個のクローンからDNAを調製して塩基配列を決定した。2個は既知遺伝子に由来するものであり、deoxycytidine kinase(aa.147^-)とNADH dehydrogenase subunit 5(aa.18^-)であった。他の5個のクローンに含まれた配列は、データベースに登録されたどの配列とも一致しなかったので未知遺伝子に由来するものと考えられた。本研究によって7つの陽性クローンを同定したが、これらは当初の予想を大きく下回る数であった。そこで、用いたtwo-hybridライブラリーのスクリーニング効率を検定するために、ライブラリーから無作為に200個のクローンを選択して部分塩基配列(EST)を決定した。その結果、3'非翻訳領域のみの場合(10%)や読みフレームのずれに加えて(30%)、開始コドンを越えて5'非翻訳領域を含むもの(34%)、膜貫通部分まで含んでしまうもの、などcDNAが長すぎるために融合蛋白ができなかったり、核内へ移行できないことが原因であることが判明した。蛋白結合を検出するためには、100アミノ酸残基程度あればよいので、新たに膜蛋白も含めて全ての結合分子が検出されるように、cDNA平均長が500bp以下である特別のライブラリーによるスクリーニングを試みている。