網膜マイクロアレイと候補SNPを用いた糖尿病性網膜症の遺伝素因の同定

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本研究開始時に所有したラット網膜由来の17,184個の3'ESTからハウスキーパーを除去したマイクロアレイを作成した。同アレイを用いてGKラットの糖尿病発症前後の網膜組織について解析を行なった。糖尿病ラットはヒトと同じ増殖性変化は示さないが、虚血性変化は生じる。そこで前後でmRNA発現が変化する遺伝子をESTアレイを用いて検索した結果、大きく変化した遺伝子群にHypoxia inducible factor(HIF)-1α遺伝子が含まれた。同遺伝子はもともと我々のヒト膵島ESTから同定されたものであるので、インスリン分泌に関する転写調節と網膜症の遺伝リンクを考える上で興味深い分子である。増殖網膜症の血管新生において血管内皮増殖因子VEGFが重要な働きを担うが、VEGF遺伝子は転写因子HIF-1αで正に転写制御される。そこで昨年度に同遺伝子の直接解析を開始した。頻度の高い13個のSNPを求めて、168人の増殖網膜症を有する症例と185人の非糖尿病者の間で関連解析を行ったところ、3'端のSNP-13の出現頻度に有意差を認めた(P=0.0171)。連鎖不平衡を考慮してSNPハプロタイプを構築し、300サンプル数を用いて成績を確認した。このSNPは近隣の3種類のミスセンス変異と有意の連鎖不平衡にあったので、本年度は同cSNPsから原因サイトの特定を試みた。性差、年齢、BMI等で補正した結果、アミノ酸置換であるSNP-10にのみ有意差を見出した。すなわち、Haplotype25-10と10-13においてマイナーアリル2/2の組み合わせにおいて出現頻度に有意差を見出した(p=0.0060,p=0.0005)。そこで現在、PCR-mutagenesisによって変異を野生型に導入し、VEGF遺伝子プロモーターのHRE配列を用いたレポーターアッセイを行ない、変異蛋白の転写調節能を解析した。