がん遺伝子治療への応用を目指したアデノ随伴ウイルスペクターシステムの開発

开发腺相关病毒载体系统用于癌症基因治疗

• 批准号: 09255255
• 负责人: 小澤 敬也
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09255255/
• 关键词: 遺伝子治療; 遺伝子導入; AAVベクター; パッケージング細胞株; ヘルパープラスミド; 遺伝子組込み; AAVS1領域

AAVベクターは安全性が高く、非分裂細胞への遺伝子導入が可能で、in situ遺伝子導入が行える利点があり、がん遺伝子治療への応用が期待されている。そこで本研究は、AAVベクターシステムの実用化に向けた開発研究を次のように進めた。1.AAVベクター作製用のパッケージング細胞株の開発に関しては、Cre-loxP系を応用したスイッチ機構によるRep蛋白質の発現制御と、さらにCap発現プラスミドの追加を試みた。その結果、Cap蛋白質の発現量が重要であることが判明した。今回開発したパッケージング細胞株は、その都度トランスフェクションにより作製する従来法に比べると、ベクターの力価がまだ低く、また長期間その性質を維持するのが困難であるため、さらに様々な改良を加えていく必要があると考えられる。2.AAV蛋白質のRepとCapを発現するヘルパープラスミドをスプリットしたベクター作製法について検討した。その結果、両者を適切な比率で用いると、従来のヘルパープラスミドと同等以上のタイタ-が得られた。蛋白質発現パターンから、Repに比べてCapの発現量の多いことが効率良くベクターを作製するうえで重要であると考えられた。この結果は、パッケージング細胞株の開発の上でも、貴重な知見であると考えている。3.AAVの特性を利用した第19番染色体AAVS1領域への部位特異的遺伝子組込み法(TVI : targeted vector integration)では、Rep78/68とITRが重要な働きをしていることを確認した。今回、Rep78変異体についてさらに検討したところ、TVI活性と細胞障害活性が相関する傾向がみられた。

AAV is highly safe, non-dividing cell vector introduction is possible, in situ vector introduction is beneficial, and the use of vector therapy is expected. This study is aimed at the further development of AAV system. 1. In the development of AAV cell lines, the development of Rep protein in Cre-loxP system was studied. The results, Cap protein production is important. In this paper, the development of cell lines in the past, the strength of cell lines in the past, the difficulty of maintaining their properties over time, and the improvement of cell lines in the future are discussed. 2. AAV protein Rep and Cap discovery process The results are as follows: 1. Protein production is more important than protein production. The results show that the development of cell lines is very important. 3. The characteristics of AAV were identified by targeted vector integration (TVI), Rep78/68 and ITR. In the present study, Rep78 showed a tendency to correlate TVI activity with cell damage activity.

项目成果

Yoshikazu Maeda: "Gene transfer into vascular cells using adeno-associated virus(AAV)vectors" Cardiovascular Res.35. 514-521 (1997)

Yoshikazu Maeda：“使用腺相关病毒 (AAV) 载体将基因转移到血管细胞”Cardioangio Res.35。

Keiko Ito: "Development of a novel selective amplifier gene for controllable expansion transduced hematopoietic cells" Blood. 90. 3884-3892 (1997)

Keiko Ito：“开发用于可控扩增转导造血细胞的新型选择性放大器基因”血液。

Masaki Kokubun: "Apoptosis-mediated regulation of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor production by genetically engineered fibroblats" Gene Therapy. (in press). (1998)

Masaki Kokubun：“基因工程成纤维细胞对重组人粒细胞集落刺激因子产生的凋亡介导调节”基因治疗。

Richard Surosky: "Adeno-associated virus Rep proteins target DNA sequences to a unique locus in the human genome" J.Virol.71. 7951-7959 (1997)

Richard Surosky：“腺相关病毒 Rep 蛋白将 DNA 序列靶向人类基因组中的一个独特位点”J.Virol.71。

Masashi Urabe: "A novel dicistronic AAV(adeno-associated virus)Vector using a short IRES(internal tibosome entry site) segment derived from hepatitis C virus genome" Gene. 200. 157-162 (1997)

Masashi Urabe：“一种新型双顺反子 AAV（腺相关病毒）载体，使用源自丙型肝炎病毒基因组的短 IRES（内部核糖体进入位点）片段”基因。