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トランスポーター膜蛋白質の機能解明を目指した活性天然物の探索

寻找旨在阐明转运膜蛋白功能的活性天然产物

基本信息

批准号：
13024249
负责人：
小林資正
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

1)P-gpを過剰発現するKB-C2株とMRP1を過剰発現するKB-CV60株に対する耐性克服物質として発見したagosterol Aに^<125>Iとアジド基を有する光親和性補助基を11位水酸基に5炭素のリンカーを介して結合させたラジオアイソトープ標識光親和性プローブを設計・合成することに成功した。2)合成した光親和性プローブを用いてMRP1に対する標識実験を行った結果、MRP1を効率よく標識でき、MRP1の基質輸送の際に必須であるグルタチオン(GSH)の存在下のみにMRP1を標識できるという優れた選択性も有していることが明らかになった。また、GSHのかわりにmethyl-S-GSHを用いても同様にMRP1を標識できたが、ethyl-S-GSHを用いると標識は半分程度に減少し、octyl-S-GSHを用いた際にはまったく標識できなかった。さらに、GSH存在下のMRP1に対する標識において、octyl-S-GSHを共存させると標識がoctyl-S-GSHの濃度依存的に拮抗阻害された。これは、かさ高いoctyl-S-GSHが基質の結合部位への接近を阻害したためと考えられ、この結果から、GSHの結合部位と基質の結合部位が近い位置に存在することが推定された。3)本プローブを用いてMRP1を標識後、限定加水分解し、分解物をSDS-PAGEで分離解析した結果、本プローブの結合部位は、MRP1のC末端側に存在することが判明した。さらに、MRP1の1202番目のアルギニンをグリシンに置換した変異体および1249番目のアルギニンをアラニンに置換した変異体を作成し、基質輸送能の検討および標識実験を行った結果、R1202Gは基質輸送能を保持しており標識もされたのに対して、R1249Aは基質輸送能が大幅に減弱し標識もされなかった。以上の結果から、MRP1の基質認識には1249番目のアルギニンが重要であると考えられた。

1) P-gp filter results KB-C2 strain MRP1 test results show that KB-CV60 strain overcomes its tolerance, see agosterol A test ^ & lt;125&gt I have an 11-position hydrochloric acid 5-carboxylic acid base and a sexual aid base. The combination of optical and sexual properties has been successfully implemented. 2) the combination of light and properties can be used to display the results of the MRP1 tag, the MRP1 rate tag, and the MRP1 token must be registered. (GSH) there is an option for the MRP1 tag to recognize the identity of the user. The methyl-S-GSH uses the same MRP1, the ethyl-S-GSH uses the MRP1, the ethyl-S-GSH uses the half-mark, the octyl-S-GSH uses the tag, and the tag uses the same token. There is an antagonistic hindrance to the degree of dependence of the MRP1 identity, the coexistence of the octyl-S-GSH identity and the degree of dependence of the octyl-S-GSH. There is a presumption that there is a close relationship between the base junction of octyl-S-GSH and GSH, and that there is a presumption that there is an error in the proximal position of the base junction of the two parts. 3) after using the label "MRP1", limiting the decomposition of water, analyzing the results of the separation analysis of the decomposed product "SDS-PAGE", the bonding site of this product, and the existence of the "C-terminal" of MRP1, the results of separation and analysis of the decomposed products were determined. In terms of data, MRP1 1202, and so on, in 1249, there are significant changes in the system, the basic transport, the results of the application, the R1202G base transport, and the R1249A transport. As a result of the above results, MRP1 has learned that 1249 items are important and important.