7本膜貫通型レチナール異性化酵素・レチノクロムの結晶化とロドプシンとの構造比較

图7 跨膜视网膜异构酶/视黄红的结晶及与视紫红质的结构比较

• 批准号: 13033022
• 负责人: 寺北 明久
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13033022/
• 关键词: ロドプシン; レチノクロム; 光異性化酵素; レチナール; 立体構造; 生物マシナリー; GPCR; 結晶化; G蛋白質供役受容体; レチナール異性化酵素; 膜蛋白質; 蛋白質発現系

ロドプシンは"inverse agonist"として11シス型レチナールを結合しており、光受容によりレチナールが"agonist"である全トランス型に異性化され、蛋白質が構造変化し、G蛋白質を活性化する。一方、レチノクロムは、ロドプシンとは逆に全トランス型レチナールをリガンドとし、11シス型に光異性化する(ロドプシンに発色団を供給するレチナール異性化酵素)。本研究では、同じ7本膜貫通型構造を有する両蛋白質が、どのような三次元構造的な制御を受けて、異なる「生物マシナリー」を実現しているのかを構造学的に明らかにするために、精製したレチノクロムを用いて、高濃度勾配蒸気拡散法により「ヘリックス配置の同定が可能な結晶」の作製をめざした。また、培養細胞から得たロドプシンの結晶化にも取り組んだ。培養細胞系の確立:レチノクロムを恒常的に2mg/L発現する細胞系を、HEK293Sを用いて、作製することに成功した。また、ロドプシンについてもほぼ同様の細胞系を確立した。これらの発現系をベースとし、単クローン抗体架橋アガロースを用いたカラムクロマトグラフィーにより、4.5mg/月以上の高度精製レチノクロムを得ることに成功した。レチノクロムについては、高濃度勾配蒸気拡散法により再現性よく結晶化する条件を見い出すことに成功した。現在、大きく成長した結晶について、ヘリックス配置の同定をめざし、X線回折を行いつつある。ロドプシンについては、野生型では高品質の結晶を再現性よく得ることに成功している。また、変異体についても野生型同様に結晶化できる条件を見いだした。

ロ ド プ シ ン は "inverse agonist" と し て 11 シ ス type レ チ ナ ー ル を combining し て お り, light let に よ り レ チ ナ ー ル が "agonist" で あ る full ト ラ ン ス type subjects に さ れ, protein が structure - し, G protein を activeness す る. Party, レ チ ノ ク ロ ム は, ロ ド プ シ ン と は inverse に full ト ラ ン ス type レ チ ナ ー ル を リ ガ ン ド と し, 11 シ ス type に light subjects す る (ロ ド プ シ ン に 発 color 団 を supply す る レ チ ナ ー ル heterosexual enzyme). This study で は, with 7 transmembrane type structure を じ す る struck protein が, ど の よ う な な of three dimensional structure system of imperial を by け て, different な る "biological マ シ ナ リ ー" を be presently し て い る の か を tectonics に Ming ら か に す る た め に, refined し た レ チ ノ ク ロ ム を with い て, high concentration of hook with steaming 気 company, scattered method に よ り "ヘ リ ッ ク の with ス configuration It is determined that が may な crystallize が to make をめざ た た. Youdaoplaceholder0, culture cells ら ら to obtain たロドプシ に, <s:1> crystallize に to extract the また group んだ. Culture cell lines の established: レ チ ノ ク ロ ム を constant に 2 mg/L 発 now す を る cell line, HEK293S を with い て, cropping す る こ と に successful し た. Youdaoplaceholder0, ロドプシ に に て て ほぼ ほぼ the same type of <s:1> cell line を established た. こ れ ら の 発 now is を ベ ー ス と し, 単 ク ロ ー ン antibody bridging ア ガ ロ ー ス を with い た カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り, 4.5 mg/month or more highly refined の レ チ ノ ク ロ ム を have る こ と に successful し た. レ チ ノ ク ロ ム に つ い て は, high concentration of hook with steaming 気 company, scattered method に よ り reproducibility よ く crystallization す る conditions を see い out す こ と に successful し た. Now, big き く growth し た crystallization に つ い て, ヘ リ ッ ク ス configuration の with fixed を め ざ し, X line back to the fold line を い つ つ あ る. ロ ド プ シ ン に つ い て は, wild type で は の high quality crystal を reproducibility よ く have る こ と に successful し て い る. ま た, - variant に つ い て も wild type with others に crystallization で き る conditions を see い だ し た.

项目成果

T.Nagata: "Isomer-specific interaction of the retinal chromophore with threonine-118 in rhodopsin"J.Phys.Chem.. 106. 1969-1975 (2002)

T.Nagata：“视紫红质中视网膜发色团与苏氨酸 118 的异构体特异性相互作用”J.Phys.Chem.. 106. 1969-1975 (2002)

M.Koyanagi: "Amphioxus homologs of Go-coupled rhodopsin and peropsin having 11-cis-and all-trans-retinals as thier chromophores"FEBS Lett.. 531. 525-528 (2002)

M.Koyanagi：“Go 偶联视紫红质和视紫红质的文昌鱼同系物具有 11-顺式-和全反式-视网膜作为其发色团”FEBS Lett.. 531. 525-528 (2002)

T.Nagata: "Isomer-specific interaction of the retinal chromophore with threonine-118 in rhodopsin"J. Phys. Chem.. (印刷中). (2002)

T. Nagata：“视紫红质中视网膜发色团与苏氨酸 118 的异构体特异性相互作用”J. Phys Chem.（出版中）。

A.Terakita: "Functional interaction between bovine rhodopsin and G protein transducin."J.Biol.Chem.. 277. 40-46 (2002)

A.Terakita：“牛视紫红质和 G 蛋白转导蛋白之间的功能相互作用。”J.Biol.Chem.. 277. 40-46 (2002)

Y.Nakashima: "Origin of the vertebrate visual cycle : retinal photoisomerase and two putative visual cycle proteins are expressed in whole brain of a primitive chordate"J. Comp. Neurol.. (印刷中). (2003)

Y. Nakashima：“脊椎动物视觉周期的起源：视网膜光异构酶和两种假定的视觉周期蛋白在原始脊索动物的整个大脑中表达”J. Comp。