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染色体工学を用いたセントロメアを中心とするゲノムオペレーティングシステムの解明

利用染色体工程阐明以着丝粒为中心的基因组操作系统

基本信息

批准号：
14014255
负责人：
深川竜郎
金额：
$ 3.84万
依托单位：
The Graduate University for Advanced Studies
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14014255/
关键词：
ゲノム工学セントロメア CENP-A DT40 Nuf2 プロテオミクス染色体工学 FRAP

项目摘要

ゲノム複製や分配が正常に行われるために働くゲノムオペレーティングシステム(ゲノムOS)を理解することは、ゲノム配列が解読された後のゲノム生物学の中心的な課題の一つである。本研究では複雑なゲノムOSの内、ゲノム分配機構に焦点を当て染色体工学的な手法を用いて、高等動物セントロメアの形成機構の解明を目指している。セントロメアは染色体分配に本質的な役割を担うDNA-タンパク質の複合体である。我々は全真核生物に共通した分配機構の解明を目指し、各種セントロメアタンパク質の機能解析を行っている。本年度は、ニワトリB細胞由来のDT40細胞を用いてCENP-A、Nuf2、ZW250を対象に研究を進めた。CENP-AとNuf2については詳細なgenotype解析を行い条件的ノックアウト細胞の樹立を確認した。ZW250については、細胞内局在を明らかにできるなどの研究の進展はあったが、ノックアウト株の樹立にまではいたっていない。CENP-Aのノックアウト細胞の解析の結果、細胞分裂時期のみならず、間期にも異常が生じることが明らかになった。また、CENP-A欠損細胞で、CENP-C,-H,-Iの局在異常が認められた。Nuf2のノックアウト細胞は、約450分の細胞分裂の遅延が起きた後、次の細胞周期に進行することなく死滅した。Nuf2の欠損した染色。体のセントロメアにはCENP-C、-H、-Iが存在していた。また、Nuf2がMad2と直接結合することが明らかになったが、ノックアウト細胞でBubR1の局在異常は認められなかった。Nuf2の欠損細胞における細胞分裂遅延は、チェックポイント依存的であるため、BubR1の活性化がその要因の一つであると考えられた。さらに、FRAP実験を行いNuf2は間期ではダイナミックな挙動であるが、分裂期では非常に安定した構造をとることが明らかになった。Nuf2-GFPを発現するDT40細胞を樹立して抗GFP抗体ビーズを用いた免疫沈降を行い、得られたバンドをLC-MS/MSを用いたプロテオミクス解析することによって新規セントロメアタンパク質を得た。

To understand this, we need to allocate resources to the central issue of biology. This study focuses on the application of chromosome engineering techniques in the study of the internal and external distribution mechanisms of complex organisms, and on the elucidation of the mechanisms for the formation of higher animal organisms. The chromosome assignment is essential for the DNA-DNA complex. We are responsible for the analysis of the common distribution mechanism of all nuclear organisms, and the functional analysis of various types of sites. This year, the study on the origin of DT40 cells in CENP-A, Nuf2 and ZW250 cells was carried out. CENP-A and Nuf2 can be used to analyze the genotype in detail and confirm the establishment of cells. ZW250 is a new type of cell that can be used to control the growth of cells. CENP-A analysis results, cell division period and interphase abnormalities CENP-A, CENP-C,-H,-I are abnormal cells. Nuf2 cells die during the second cell cycle after approximately 450 minutes of cell division delay. Nuf2 is deficient in staining. CENP-C, -H and-I are all present in the body. Nuf2 and Mad2 are directly combined with BubR1 and BubR2. Nuf2 is deficient in cell division, cell division is delayed, and BubR1 is activated. In the middle of the division period, there is a very stable structure. Nuf2-GFP expression in DT40 cells to establish anti-GFP antibodies in the use of immuno-sedimentation, access to LC-MS/MS in the use of mobile phone analysis, and the new protocol to access quality.