RNAiによるラミニン鎖の会合と分泌を管理する分子群の解析

通过 RNAi 分析控制层粘连蛋白链缔合和分泌的分子

• 批准号: 14037229
• 负责人: 北川 泰雄
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14037229/
• 关键词: ラミニン; RNAi; ショウジョウバエ; ゲノムプロジェクト; チオレドキシン; シグナル配列; KDEL; 分子シャペロン

α1-α5鎖、β1-β4鎖とγ1-γ3鎖が互換的に会合して19種類のαβγ三量体を作るラミニン族は、動物組織構築に寄与する基底膜の主成分である。胚発生の時期と部位に応じた種類のαβγ三量体を合成・分泌するために、ラミニン鎖の細胞内会合と分泌は高度に管理されている。本研究では、我がショウジョウバエ細胞で確率したPNAι法を活用して、この管理に寄与する分子群を網羅的に検索しゅようとした。すなわち、1)ショウジョウバエ体液細胞由来のKc167細胞が大量のラミニンを合成・分泌すること、2)この細胞の培地に二本鎖RNAを添加するだけで標的遺伝子の発現抑制が起こること、3)ショウジョウバエ・ラミニンのα1/5鎖、β鎖及びγ鎖のそれぞれに特異的な抗血清を取得していること、4)ショウジョウバエではゲノムプロジェクトが完了しており、特徴的モチーフをプローブに機能未知の遺伝子をデータベースから検索してRNAiが試せる等の利点を活用して、ショウジョウバエ・ラミニンの合成と分泌機構に標的を絞り、その鎖間会合と分泌制御に関与する遺伝子を網羅的に検索して、それらの機能を解析しようとした。このために、データベースから選択した15種類の候補遺伝子の部分配列を持つ二本鎖RNAを作製し、これを投与したKc167細胞におけるラミニン各鎖の合成、鎖間会合と細胞外分泌を手掛かりにして品質管理に関わる遺伝子を検索した。その結果、チオレドキシン・モチーフ、小胞体内腔輸送シグナル配列及び小胞体内腔残留配列(KDEL)等を持つ5個の遺伝子のRNAiがラミニン分泌を抑制することを発見した。その中には、純正PDIよりも強くラミニ合成に作用する遺伝子が含まれていた。

α1-α5, β1-β4 and γ1-γ3 interchanges are the main components of the basement membrane, which are associated with 19 species of αβγ triad. Embryo development stage, location, species, synthesis, secretion, and intracellular synthesis are highly regulated. In this study, we used the PNA method to determine the accuracy of cell culture, and the method was used to manage the molecular population. 1) Kc167 cells derived from humoral cells synthesize and secrete large amounts of protein; 2) the cells are cultured with the addition of two-lock RNA; 3) specific antisera against α1/5-lock, β-lock and γ-lock proteins are obtained; 4) We can make full use of the advantages of using the unique features of the robot to explore and detect genes with unknown functions and RNAi trials. We can also make use of the advantages of the robot to explore the synthesis and secretion mechanisms of the robot, and the genes involved in the secretion control and control of the fusion between the chains. We can analyze the functions of the robot. Part of the sequence of 15 candidate genes was selected, and two key RNA sequences were used to synthesize and integrate the key genes into Kc167 cells. The results showed that 5 genes were detected in RNAi and inhibition of RNAi secretion, such as the gene expression, gene expression, intracellular transport, and KDEL. In addition, the pure PDI can be used to enhance the synthesis function of the gene.

项目成果

Tanaka K, Kitagawa Y, Kadowaki T: "Drosophila segment polarity gene product porcupine stimulates the posttranslational N-glycosylation of wingless in the endoplasmic reticulum"J Biol Chem.. 277(15). 12816-12823 (2002)

Tanaka K、Kitakawa Y、Kadowaki T：“果蝇节段极性基因产物豪猪刺激内质网中 wingless 的翻译后 N-糖基化”J Biol Chem.. 277(15)。

後藤彰, 北川泰雄: "ポストゲノム時代におけるRNA干渉法の役割"バイオサイエンスとインダストリー. 60(5). 26-29 (2002)

Akira Goto，Yasuo Kitakawa：“RNA 干扰在后基因组时代的作用”《生物科学与工业》60(5) (2002)。

Toriyama K, Kawaguchi N, Kitoh J, Tajima R, Inou K, Kitagawa Y, Torii S.: "Endogenous adipocyte Precursor cells for regenerative soft-tissorcupine stimulates the posttranslational N-glycosylation of wingless in the endoplasmic reticulum"Tissue Engineering

Toriyama K、Kawaguchi N、Kitoh J、Tajima R、Inou K、Kitakawa Y、Torii S.：“再生软组织的内源脂肪细胞前体细胞刺激内质网中无翅的翻译后 N-糖基化”组织工程

Tajima R, Toriyama K, Sano R, Inou K, Oda H, Torii S, Kitagawa Y.: "Reversible heat-denaturation of Matrigel retains biological activity inducing differentiated phenotype of primary cultured hepatocytes and inducing de novo adipogenesis"Tissue Engineering

Tajima R、Toriyama K、Sano R、Inou K、Oda H、Torii S、Kitakawa Y.：“基质胶的可逆热变性保留了诱导原代培养肝细胞分化表型和诱导从头脂肪生成的生物活性”组织工程

Okazaki I, Suzuki N, Nishi N, Utani A, Matsuura H, Shinkai H, Yamashita H, Kitagawa Y, Nomizu M.: "Identification of biologically active sequences in the laminin alpha 4 chain G domain"J Biol Chem. 277(40). 37070-37078 (2002)

冈崎 I、铃木 N、西 N、Utani A、松浦 H、新海 H、山下 H、北川 Y、野水 M.：“层粘连蛋白 α 4 链 G 结构域中生物活性序列的鉴定”J Biol Chem。