RNA干渉法の動物細胞工学への展開

RNA干扰方法在动物细胞工程中的应用

• 批准号: 14656037
• 负责人: 北川 泰雄
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14656037/
• 关键词: RNA干渉法; ノックアウトマウス; インターフェロン; アポトーシス; マウス初期胚; T遺伝子; 中胚葉; ササン解析

2本鎖RNA(dsRNA)による特定遺伝子のRNA干渉法(RNAi)は、ノックアウトマウスに比較べて操作が簡便なので、これに取って代わる技術になる。しかし、RNAiはあらゆる生物系で機能するのではなく、インターフェロン経路を介する「非特異的mRNA分解機構」が優先的に作動する哺乳動物系では、狙ったmRNAの特異的分解が起こる前にアポトーシス機構が作動してdsRNAを取り込んだ細胞が死ぬために目的を達せられない。この非特異的RNA分解を回避するには、1)インターフェロン経路が未発達の初期発生段階で発現する遺伝子を標的にする。2)インターフェロン経路が認識する長鎖dsRNAの使用を避け、標的mRNA配列中の30塩基以下の長さの配列を逆位反復配列として組み込んだベクターを用いてトランスジェニック(TG)マウスを作製し、その発現産物が短鎖dsRNAとなってRNAiを引き起こす様な実験を設計するなどの対策がある。今回の研究では、両基準を満たすべく、マウス初期胚円筒胚(6-7dpc)で発現してnotocode等の中胚葉系を誘導するBrachyury (T)のRNAiを試みた。Brachyury (T)のRNAiが機能した時には、ヘテロ変異体の表現型である尾が短い形質が現れると期待したからである。また、TGマウスを作製するためのベクターとしてBrachyury (T)遺伝子のORF配列中の952ntおよび996ntより下流の23塩基分の配列をmouse U6 promoterの影響下に逆位反復配列として発現するものを設計した。この受精卵注入によって約50頭のマウスを得たが、それらの何れもが正常長の尾を持っていたので、今回の実験ではBrachyury (T)のRNAiは作動しなかったと結論した。念のために、尾から抽出したゲノムDNAに対するササン解析を行ったが、50頭のマウスから抽出した全ての標本に対して巨大DNA部分に弱いバンドが検出されただけであった。

2. RNA-locking (dsRNA) specific RNA interference method (RNAi)ックアウトマウスにComparison of べてoperationがeasyなので,これにtakeってgenerationわるtechniqueになる.しかし、RNAiはあらゆるBiological system でfunctional するのではなく、インターフェ"Non-specific mRNA decomposition mechanism" is a priority action of "Non-specific mRNA decomposition mechanism" Animal system's specific decomposition of animal and sniper mRNA's original structureがACTIVE してdsRNA をGET り込んだCELL が死ぬためにObject を达せられない.この Non-specific RNA decomposition を avoidance す る に は, 1) イ ン タ ー フ ェ ロ ン経路 が 発达 の Initial growth stage で発 す る 伝子 を に す る. 2) The use of long-lock dsRNA and target mR In the NA arrangement, there is a length of less than 30 bases, a reverse arrangement, a reverse arrangement, a repeated arrangement, and a set of み込んだベクターをMade with いてトランスジェニック(TG)マウスをし, その発existing product が short lock d sRNAとなってRNAiをinducingき起こす様な実験をdesignするなどの対泽がある. This time's research is based on the basic principles of early embryonic tube embryo (6-7dpc), notocode, etc., mesodermal lineage induction, Brachyury (T), and RNAi test. Brachyury (T) RNAi's functional function and timing, allotype and phenotype, short shape and quality, and expectation.また、TGマウスをproduced by するためのベクターとしてBrachyury (T) 952nt in the ORF arrangement, 996nt in the downstream, 23 base points in the arrangement, under the influence of the mouse U6 promoter, the reverse position is repeated in the arrangement, and the design is in place. About 50 fertilized eggs are injected into the fertilized eggs into the fertilized eggs.がNormal long tail を holding っ て い た の で , and this time の実験 で は Brachyury (T)のRNAiはactionしなかったと Conclusionした. Nian のために, tail からdraw したゲノムDNA に対するササンanalysis を行ったが, 50-head のマウスThe whole specimen was extracted and the huge DNA part was extracted.

项目成果

Tanaka K, Kitagawa Y, Kadowaki T: "Drosophila segment polarity gene product porcupine stimulates the posttranslational N-glycosylation of wingless in the endoplasmic reticulum"J Biol Chem.. 277(15). 12816-12823 (2002)

Tanaka K、Kitakawa Y、Kadowaki T：“果蝇节段极性基因产物豪猪刺激内质网中 wingless 的翻译后 N-糖基化”J Biol Chem.. 277(15)。

後藤彰, 北川泰雄: "ポストゲノム時代におけるRNA干渉法の役割"バイオサイエンスとインダストリー. 60(5). 26-29 (2002)

Akira Goto，Yasuo Kitakawa：“RNA 干扰在后基因组时代的作用”《生物科学与工业》60(5) (2002)。

Toriyama K, Kawaguchi N, Kitoh J, Tajima R, Inou K, Kitagawa Y, Torii S.: "Endogenous adipocyte Precursor cells for regenerative soft-tissorcupine stimulates the posttranslational N-glycosylation of wingless in the endoplasmic reticulum"Tissue Engineering

Toriyama K、Kawaguchi N、Kitoh J、Tajima R、Inou K、Kitakawa Y、Torii S.：“再生软组织的内源脂肪细胞前体细胞刺激内质网中无翅的翻译后 N-糖基化”组织工程

Tajima R, Toriyama K, Sano R, Inou K, Oda H, Torii S, Kitagawa Y.: "Reversible heat-denaturation of Matrigel retains biological activity inducing differentiated phenotype of primary cultured hepatocytes and inducing de novo adipogenesis"Tissue Engineering

Tajima R、Toriyama K、Sano R、Inou K、Oda H、Torii S、Kitakawa Y.：“基质胶的可逆热变性保留了诱导原代培养肝细胞分化表型和诱导从头脂肪生成的生物活性”组织工程

Okazaki I, Suzuki N, Nishi N, Utani A, Matsuura H, Shinkai H, Yamashita H, Kitagawa Y, Nomizu M.: "Identification of biologically active sequences in the laminin alpha 4 chain G domain"J Biol Chem. 277(40). 37070-37078 (2002)

冈崎 I、铃木 N、西 N、Utani A、松浦 H、新海 H、山下 H、北川 Y、野水 M.：“层粘连蛋白 α 4 链 G 结构域中生物活性序列的鉴定”J Biol Chem。