RNA干渉法の動物細胞工学への展開

RNA干扰方法在动物细胞工程中的应用

基本信息

批准号：
14656037
负责人：
北川泰雄
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

2本鎖RNA(dsRNA)による特定遺伝子のRNA干渉法(RNAi)は、ノックアウトマウスに比較べて操作が簡便なので、これに取って代わる技術になる。しかし、RNAiはあらゆる生物系で機能するのではなく、インターフェロン経路を介する「非特異的mRNA分解機構」が優先的に作動する哺乳動物系では、狙ったmRNAの特異的分解が起こる前にアポトーシス機構が作動してdsRNAを取り込んだ細胞が死ぬために目的を達せられない。この非特異的RNA分解を回避するには、1)インターフェロン経路が未発達の初期発生段階で発現する遺伝子を標的にする。2)インターフェロン経路が認識する長鎖dsRNAの使用を避け、標的mRNA配列中の30塩基以下の長さの配列を逆位反復配列として組み込んだベクターを用いてトランスジェニック(TG)マウスを作製し、その発現産物が短鎖dsRNAとなってRNAiを引き起こす様な実験を設計するなどの対策がある。今回の研究では、両基準を満たすべく、マウス初期胚円筒胚(6-7dpc)で発現してnotocode等の中胚葉系を誘導するBrachyury (T)のRNAiを試みた。Brachyury (T)のRNAiが機能した時には、ヘテロ変異体の表現型である尾が短い形質が現れると期待したからである。また、TGマウスを作製するためのベクターとしてBrachyury (T)遺伝子のORF配列中の952ntおよび996ntより下流の23塩基分の配列をmouse U6 promoterの影響下に逆位反復配列として発現するものを設計した。この受精卵注入によって約50頭のマウスを得たが、それらの何れもが正常長の尾を持っていたので、今回の実験ではBrachyury (T)のRNAiは作動しなかったと結論した。念のために、尾から抽出したゲノムDNAに対するササン解析を行ったが、50頭のマウスから抽出した全ての標本に対して巨大DNA部分に弱いバンドが検出されただけであった。

使用双链RNA（DSRNA）对特定基因的RNA干涉法（RNAi）是一种取代此基因的技术，因为它比敲除小鼠更容易操作。但是，RNAi在任何生物系统中都不起作用，而是在通过干扰素途径“非特异性mRNA降解机制”的哺乳动物系统中，优先激活了凋亡机制，在靶向特定的mRNA发生特定的特定降解以及导致dsRNA死亡的细胞之前，凋亡机制会激活。为了避免这种非特异性RNA降解，1）在干扰素途径的早期发育阶段表达的靶基因。 2）有一些措施，例如避免使用干扰素途径识别的长链dsRNA，并使用矢量将目标mRNA序列中的30个碱基的序列或更少的序列纳入为倒重复序列，并且设计表达产物的设计实验变速了dsRNA和引起RNAi。在本研究中，我们尝试了在早期小鼠圆柱胚（6-7dPC）中表达的Brachyury（T）的RNAi，并诱导了中胚层系统（例如Notocode），以满足这两个标准。这是因为我们期望，当Brachyury（T）功能的RNAi（一种短的尾部特征）即将出现。此外，作为生成TG小鼠的载体，在小鼠U6启动子的影响下，设计为Brachyury（T）基因的ORF序列中的23碱基序列，在Brachyury（T）基因的ORF序列中的996NT序列被设计为倒重复序列。这种受精卵的注射产生了约50只小鼠，但由于两者都有正常的尾巴，因此我们得出结论，Brachyury（T）RNAi在该实验中不起作用。为了安全起见，我们对从尾巴提取的基因组DNA进行了SASAN分析，但是在从50只小鼠中提取的所有试样中，在巨型DNA部分中仅检测到弱条带。