環境化学物質のアンドロゲン・男性ホルモン受容体結合能の高効率評価測定法の開発

开发环境化学物质与雄激素/雄性激素受体结合能力的高效评价方法

• 批准号: 14042248
• 负责人: 下東 康幸
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14042248/
• 关键词: 環境; 男性ホルモン; 受容体; 化学物質; ホルモン; 環境ホルモン; 内分泌撹乱化学物質

内分泌撹乱作用が懸念される非常に多数の既存化学物質を、迅速にスクリーニングする必要がある。化学物質の内分泌撹乱作用の評価においては、受容体結合親和性のみならず、ホルモン作用を持つのか、抗ホルモン作用を持つのかについても試験しなければならない。ところで、ホルモンや化学物質が受容体(アポ型)に結合すると、受容体のコンホメーションが変化する(ホロ型)。我々は最近、エストロゲン受容体についてこうしたコンホメーション変化を感知(センシング)する抗体の調製に成功した。そして、この抗体を用いて化学物質の受容体結合性とホルモン活性を同時に解析・評価できるアッセイ系の構築に成就した。本研究ではまず、特異的な結合性がみられた約300種を含む合計503化学物質について、ポリクローナル抗体を用いた競合ELISA試験の原理に基づくアッセイを実施した。各化学物質の試験溶液(10^<-10>〜10^<-4>M)を一定量の受容体と作用させたのち、固定化した抗原ペプチドと共存下でセンシング抗体に競合させた。解析の結果得られたシグモイド曲線から、最大抗体応答性(%)と抗体応答有効濃度(EC_<50>)を求めた。その結果、図1に示すように、抗体応答有効濃度(横軸)を指標にとして見たとき、活性の強弱について5つのグループに大まかに分けられることが判明した。こうして、現在入手可能なすべての化学物質の試験の結果、第1〜第3グループに天然エストロゲンを含む61化学物質が内分泌撹乱候補物質として認められた。アンドロゲン受容体のコンホメーション変化センシング抗体の作製については、抗体の作製は完了しているものの、現在までリガンド存在、非存在下での有効な応答差を得るに至っていない。一方、アンドロゲンに蛍光核を結合させた新規な蛍光トレーサーを化学合成し、これを用いた結合試験法の開発に成功した。B/F分離なしのアッセイ系確立のため条件検討を継続しているが、現在まで有効な方法の確立に至っていない。

Endocrine disruption is a major concern for most existing chemicals, and it is necessary to quickly remove them. Evaluation of endocrine disrupting effects of chemical substances, receptor binding affinity, anti-endocrine effects, etc. The chemical substance is bound to the receptor (type), and the receptor is changed to type. We have been successfully modulating antibodies in recent years. This antibody is used to analyze, evaluate and construct receptor binding properties and receptor activity of chemical substances. In this study, the specific binding ability of about 300 kinds of chemical substances was determined, and the principle of ELISA for antibody was analyzed. The test solution of each chemical substance (10^<-10>~ 10^<-4>M) shall be used for the detection and immobilization of antigen and antibody. The results of the analysis were as follows: curve, maximum antibody response (%) and antibody response concentration (EC_<50>). The results are as follows: 1. Antibody response concentration (horizontal axis). 2. Activity level. 3. The results of the tests on chemical substances that may be present in the first to third groups include 61 chemical substances that are candidates for endocrine disruption. The antibody production process is complete, and now there is a difference between the presence and absence of the antibody. A new method of chemical synthesis was developed by combining the two methods. B/F separation is established by the condition of the separation, and the method of separation is established.

项目成果

Asai D.et al.: "Biochemical Evaluation of Hormonal Activity of Endocrine Disruptors by Sensing the Estrogen Receptor Conformation Changes"Peptide Science 2002. 127-130 (2003)

Asai D.等人：“通过感知雌激素受体构象变化对内分泌干扰物的激素活性进行生化评价”肽科学 2002. 127-130 (2003)

Urushitani H.et al.: "Cloning and characterization of estrogen receptor alpha in mummichog, Fundulus heteroclitus"MOLECULAR AND CELLULAR ENDOCRINOLOGY. 203(1-2). 41-50 (2003)

Urushitani H.等人：“mummichog、Fundulushetroclitus 中雌激素受体 α 的克隆和表征”分子和细胞内分泌学。

Daisuke Asai et al.: "Biochemical Evaluation of Hormonal Activity of Endocrine Disruptors by Sensing the Estrogen Receptor Conformation Changes"Peptide Science 2002. (印刷中). (2003)

Daisuke Asai 等人：“通过感知雌激素受体构象变化对内分泌干扰物的激素活性进行生化评估”，肽科学 2002 年（出版中）。

Ishimori H.et al.: "The effect of the peptide corresponding to the No.12 α-helix on the conformation change in the estrogen receptor activation"Peptide Science 2002. 437-438 (2003)

Ishimori H.等：“对应于No.12 α-螺旋的肽对雌激素受体激活中构象变化的影响”Peptide Science 2002. 437-438 (2003)

In Y.et al.: "Aggregation feature of fluorine-substituted benzene rings and intermolecular C-H ‥F interaction : Crystal structure analyses of mono- and trifluoro-L-phenylalanines"CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN. 51(11). 1258-1263 (2003)

Y. 等人：“氟取代苯环的聚集特征和分子间 C-H‥F 相互作用：单氟和三氟-L-苯丙氨酸的晶体结构分析”《化学与药物公报》51(11)。 2003）