内分泌撹乱物質のホルモン受容体結合能および活性化能の同時評価測定法の開発

开发同时评价激素受体结合和内分泌干扰物激活能力的测量方法

• 批准号: 13027268
• 负责人: 下東 康幸
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13027268/
• 关键词: 内分泌撹乱物質; 環境ホルモン; 抗体; ホルモン受容体; 核内受容体; エストロゲン

内分泌撹乱作用が懸念される非常に多数の既存化学物賓を、迅速にスクリーニングする方法が必要とされている。我々は最近、エストロゲン様作用が疑われる化合物500種類について受容体結合試験を実施し、結合親和性がノニルフェノールよりも数十倍から数百倍も強い化合物数種を見い出した。しかしながら、これら化学物質の内分泌撹乱作用の評価においては、受容体結合後の活性発現がホルモン作用なのか、抗ホルモン作用なのか、の判別が必要である。こうしたなか現在検討されているスクリーニング法は、これらについてそれぞれ別途に試験されねばならず、きわめて非効率的である。ところで、ホルモンや化学物質が受容体(アポ型)に結合すると、受容体の構造・コンホメーションが変化する(ホロ型)。女性ホルモン・エストロゲン受容体のリガンド複合体のX線結晶解析から、そのコンホメーション変化の内容はアゴニストと、アンタゴニストでは異なる。本研究ではまず、こうした受容体コンホメーション変化の違いを感知・センシングする抗体の調製を試みた。ホルモン結合による核内受容体(転写因子)のコンホメーションの特徴的な変化は、C末端部αヘリックス(H12)である。そこで、これをエピトープとする抗ウサギ・ポリクローナル抗体を調整した。精製した抗体はアゴニスト・17β-エストラジオール(E2)とアンタゴニスト・4-ヒドロキシタモキシフェンを識別した。さらに、アゴニストでも、E2とエストロン(E1)とを識別した。そこで、一連のアルキルフェノールについて検討したところ、E1様の応答を示すことが判明した。これらを総合的に解析したところ、本抗体のみを用いて検討することで、内分泌撹乱物質のホルモン受容体結合能と活性化能を同時に特異的に定量・測定できるアッセイ系の構築が可能であることが判明した。

Endocrine 撹 disorderly が suspense さ れ る very に most の existing chemicals bing を, rapid に ス ク リ ー ニ ン グ す る method が necessary と さ れ て い る. I 々 は recently, エ ス ト ロ ゲ ン others role が suspected わ れ る compound 500 kinds に つ い て by let body combined with test を be し, combined with affinity が ノ ニ ル フ ェ ノ ー ル よ り も dozens of times か ら hundreds times strong も see several を い い compounds out し た. し か し な が ら, こ れ ら chemicals endocrine 撹 disorderly の の review 価 に お い て は combination, let body の active 発 now が ホ ル モ ン role な の か, resisting ホ ル モ ン role な の か, discriminant が の necessary で あ る. Beg さ こ う し た な か now 検 れ て い る ス ク リ ー ニ ン グ は, こ れ ら に つ い て そ れ ぞ れ don't way に test さ れ ね ば な ら ず, き わ め て non working rate で あ る. と こ ろ で, ホ ル モ ン が や chemicals by let body (ア ポ type) に combining す る と, let body の tectonics コ ン ホ メ ー シ ョ ン が variations change す る (ホ ロ type). Women ホ ル モ ン · エ ス ト ロ ゲ ン by let body の リ ガ ン ド complex の X-ray crystal parsing か ら, そ の コ ン ホ メ ー シ ョ ン variations change の content は ア ゴ ニ ス ト と, ア ン タ ゴ ニ ス ト で は different な る. This study で は ま ず, こ う し た by let body コ ン ホ メ ー シ ョ ン variations change の violations い を perception, セ ン シ ン グ す る antibody の modulation を try み た. ホ ル モ ン combining に よ る in nuclei by let body (planning write factor) の コ ン ホ メ ー シ ョ ン の of 徴 な - は, C terminal part alpha ヘ リ ッ ク ス (H12) で あ る. そ こ で, こ れ を エ ピ ト ー プ と す る resistance ウ サ ギ · ポ リ ク ロ ー ナ ル antibody を adjustment し た. Refined し た antibody は ア ゴ ニ ス ト · 17 beta エ ス ト ラ ジ オ ー ル (E2) と ア ン タ ゴ ニ ス ト · 4 - ヒ ド ロ キ シ タ モ キ シ フ ェ ン を recognition し た. Youdaoplaceholder0, アゴニストで アゴニストで, E2とエストロ とエストロ (E1)とを identify た. そ こ で, for の ア ル キ ル フ ェ ノ ー ル に つ い て beg し 検 た と こ ろ, E1 others の 応 answer を shown す こ と が.at し た. こ れ ら を 総 に of parsing し た と こ ろ, this antibody の み を with い て beg す 検 る こ と で, endocrine 撹 disorderly substances の ホ ル モ ン by binding energy for body can と activeness を に specific に at the same time, quantitative determination of で き る ア ッ セ イ is の build が may で あ る こ と が.at し た.

项目成果

N.Shirasu, Y.Shimohigashi: "Discriminative Disulfide-Bonding Affinity Labeling of Opioid Receptor Subtype"J. Biochem. Biophys. Methods. 49. 587-606 (2001)

N.Shirasu，Y.Shimohigashi：“阿片受体亚型的区别性二硫键亲和力标记”J。

D.Asai, et al.: "Preparation of the Antibody which Discriminate the Conformations of Ligand-bound and Ligand-free Estrogen Receptors : Application to the Quantitative Analysis of Ligand Bindings"Peptide Science 2000. 411-412 (2001)

D.Asai等人：“区分配体结合和无配体雌激素受体构象的抗体的制备：在配体结合的定量分析中的应用”肽科学2000.411-412(2001)

Y.Shimohigashi, et al.: "Nuclear receptor Binding Assay by Sensing Changes in Receptor Conformation"Environ. Sci. 8. 141-142 (2001)

Y.Shimohigashi 等人：“通过感知受体构象变化进行核受体结合测定”Environ。