アフィニティラベリングによるオピオイド受容体の結合部位の決定

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3‐ニトロ‐2‐ピリジンスルフェニル(Npys)で活性化したチオール基を持つエンケファリンは、オピオイド受容体の遊離チオール基(システイン残基)をシスルフィド結合を介してアフィニティラベルできる。本研究の目的は、機能的に重要な役割を担うこのようなオピオイド受容体システイン残基を同定することである。まず、ラット肝臓より酵素t‐RNA‐チロシンシンターゼを精製し、Npys含有前駆体ペプチドH‐D‐Ala‐Gly‐Phe‐Leu‐Cys(Npys)へのTyrの導入を検討した。しかし、Npys‐エンケファリンの生成は認められたものの、量的な単離まで至らなかった。この理由には酵素標品の純度及び前駆体ペプチドのN端にD‐アミノ酸をもつことなどが考えられた。そこで、微量でもアフィニティラベリングが可能な条件を検討したところ、[^3H]‐[D‐Ala^2,Leu^5]enkephaly‐Cys(Npys)^6はδ型を、[^3H]‐[D‐Ala^2,Leu(CH_2S‐Npys)^5]enkephalinはμ型をそれぞれ100〜150倍も高選択的にラベルできることが判明した。このため、現在^3H‐チロシンを用いて放射ラベルNpys‐エンケファリンの合成を試みている。一方、モルヒネのアンタゴニスト、ナルトレキサミンのアフィニティカラムを作製した。これにラット脳可溶化物を通し、電気泳動で調べたところ、分子量相当の受容体画分が認められ、このカラムの有効性が確認された。現在Npys‐エンケファリンを反応させた脳膜標品のアフィニティ精製を検討している。コンピュータモデリングによるシステイン残基のシミュレーションを実施したところ、受容体の細胞膜外ドメインの第一、第二ループに存在する2個のシステイン残基の可能性が示唆された。このため、立体化学的に堅固なモルヒネの異なる部位にNpys基を導入した誘導体で調べたところ、ラベルされるシステインが2個ある可能性のあることが指摘された。この新規な知見をペプチドのエンケファリンでも確認すべく、Npys誘導体をデザインした。