ES細胞の未分化状態維持に関わる因子の同定とその解析

维持ES细胞未分化状态相关因素的鉴定和分析

• 批准号: 16022213
• 负责人: 吉田 進昭
• 金额: $ 2.69万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16022213/
• 关键词: Rex-1遺伝子; Nanog遺伝子; Rox-1; ES細胞; 転写調節; 未分化状態; Creタンパク; ETn

マウス胚性幹細胞の持つ多分化能、自己増殖能がいかなる細胞内機構によって維持されているのかを解明するため、我々は未分化細胞特異的に発現する遺伝子Rex-1の制御因子、Rox-1を同定して解析を行った。ジーンターゲティング法を用いた解析により、Rox-1欠損マウスは着床前後の時期に胎性致死となることを明らかにした。また、Creタンパク質を発現させることでRox-1遺伝子を破壊できるES細胞株を用いた実験からは、ES細胞の増殖維持にとってRox-1が必須の遺伝子であることを示唆する結果を得た。また、この細胞においては内在性のRox-1の発現が役1/2に低下しており、このことを利用して、外来性のRox-1を発現させることを試みたところ、内在性のRox-1よりも数倍多い発現量が確保できることがわかった。Rox-1は、ピリミジンに富むDNA配列に結合することを明らかにした。また、未分化特異的遺伝子であるRex-1、Nanog両遺伝子の転写調節領域中にはピリミジンに富む配列が見られ、この領域がそれぞれの遺伝子のプロモーターの活性化に重要であることを示した。核抽出液中に含まれるRox-1のDNA結合活性は、ES細胞の分化に伴って減少するが、これはRox-1タンパクの量的変化によってもたらされるものではなく、Rox-1の何らかの質的変化によってもたらされることを明らかにした。ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより得られた遺伝子のひとつ、ETnのプロモーター解析を行い、未分化細胞特異的に機能するエンハンサー領域の絞込みに成功した。また、ゲルシフトアッセイにより、この領域に特異的に見られる結合活性の同定も行い、結合因子同定のためのタンパク精製条件の設定を進めた。

为了澄清细胞内机制，即保持小鼠胚胎干细胞的多能和自我增殖潜力，我们鉴定并分析了基因REX-1的调节剂ROX-1，这在未分化的细胞中特别表达。使用基因靶向的分析表明，在植入前后，ROX-1缺陷小鼠是胎儿致死的。此外，使用ES细胞系的实验可以通过表达CRE蛋白来破坏ROX-1基因的实验，这表明ROX-1是维持ES细胞增殖的必不可少的基因。此外，在该细胞中，内源性ROX-1的表达降低至1/2，当我们试图表达异物ROX-1时，我们发现表达水平比内源性ROX-1高几倍。发现ROX-1与富含嘧啶的DNA序列结合。此外，在REX-1和Nanog基因的转录调节区域中发现了富含嘧啶的序列，这些序列是未分化的特异性基因，表明该区域对于每个基因启动子的激活都很重要。核提取物中包含的ROX-1的DNA结合活性随着ES细胞的分化而降低，但这不是由ROX-1蛋白的定量变化引起的，而是由ROX-1的某些质量变化引起的。进行了ETN的启动子分析，这是通过差异杂交获得的基因之一，并成功地缩小了在未分化的细胞中专门起作用的增强子区域。此外，通过凝胶移位测定法确定了在该区域中特异性发现的结合活性，并进行了鉴定结合因子的蛋白质纯化条件的设定。