ジーントラップ法を用いた造血細胞分化関連遺伝子の単離

利用基因捕获法分离造血细胞分化相关基因

• 批准号: 08261221
• 负责人: 吉田 進昭
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Research Institute, Osaka Medical Center for Maternal and Child Health
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08261221/
• 关键词: ジーントラップ; ES細胞; 造血幹細胞; 造血細胞; 増殖因子

ES細胞は、in vivo、in vitroにおいて血球系細胞に分化することが知られている。op/opマウス由来の骨髄繊維芽細胞株OP-9を支持細胞としてES細胞を血球系細胞へと分化させる系が樹立されている。また、コラーゲンをコートしたディッシュ上で培養すると、ES細胞は高率に血球系・血管系の分化マーカーであるflkを発現するようになる。この2つの系を中心にして、ES細胞分化に関連する未知遺伝子の単離を試みた。トラップベクターはEn-2イントロンの下流にスプライシングの受容シグナル、翻訳活性を上げるためのIRESシグナル、およびLacZをマーカー遺伝子として配置、下流にはアクチンプロモーター下にネオマイシン耐性遺伝子を挿入したベクターである。このベクターをES細胞株であるD3およびE14-1細胞に導入して約4000個のES細胞クローンを樹立した。これらのクローンをプールしてOP-9上で培養し、8日目にX-gal染色を行う方法でスクリーニングした。LacZを発現する陽性細胞は非常に少なく同定は困難であったが、陽性と思われる細胞を選別後、cDNAライブラリーを作成し、クローンを同定した。約10種類のcDNAの塩基配列を決定後、未知と思われるものをプローブにして成熟マウスの各組織での発現をノザン法にて解析したが、ある程度の組織特異性はみられるものの、造血系組織で特異的に発現しているクローンは得られなかった。今後、さらなる解析を行うとともに、新規のトラップクローンの樹立を試みる。

已知ES细胞在体内和体外分化为血细胞系。已经建立了一个系统，该系统使用源自OP/OP小鼠的髓系成纤维细胞系OP-9将ES细胞区分为血细胞系，作为支撑细胞。此外，当在胶原蛋白涂层的盘子上培养时，ES细胞成为高度表达的FLK，这是血细胞和脉管系统分化的标志。我们试图与这两个系统分离与ES细胞分化有关的未知基因。陷阱矢量是一个载体，其中EN-2内含子下游的剪接接受信号，增加了翻译活性的IRES信号，将LACZ作为标记基因放置，而在肌动蛋白启动子下，将Neomycin抗性基因插入下游。将该载体引入ES细胞系D3和E14-1细胞中，以建立大约4,000个ES细胞克隆。将这些克隆汇总并在OP-9上进行培养，并在第8天通过X-Gal染色进行筛选。尽管表达LACZ的阳性细胞很少，但很难识别，但是在清除了似乎是阳性的细胞后，创建了一个cDNA库来识别克隆。在确定了大约10种cDNA的碱基序列后，使用成熟小鼠的每个组织中未知物质的探针分析了结果，但是尽管观察到了某些组织特异性，但未获得在造血组织中特异性表达的克隆。将来，将进行进一步的分析，并将尝试新的陷阱克隆。