受容体分子のレーザー分子不活化による膜インターフェイスにおけるシグナル変換制御

通过受体分子的激光分子失活控制膜界面的信号转导

基本信息

批准号：
16048206
负责人：
菊地和也
金额：
$ 2.3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

生体分子の機能解明には,分子生物学・薬理学・生化学等様々な手法を用いて標的分子を不活化する研究が有効であるが,中でもレーザー分子機能不活性化法(Chromophore-assisted Laser Inactivation : CALI)は時間的・空間的に厳密に制御した不活性化ができるため注目を集めている.CALIは,色素が結合した抗体あるいはリガンドを細胞内に導入し,標的分子に結合した後,この結合体にレーザーを照射し色素から生じるラジカルにより標的分子を不活性化する方法である.CALIは特定の時間と場所で不活性化ができるという利点を持つものの,標的分子の認識に抗体を用いるために細胞内導入が難しく,生理的条件下の応用は困難であった.そこで,細胞膜透過性のCALIプローブをデザイン・合成することで,細胞をすりつぶさないで細胞が生きた状態のまま標的分子を特異的に不活性化できる手法の開発を目的とした。CALIの標的分子としては,細胞内Ca^<2+>動態を主に制御しているイノシトール3リン酸(IP_3)受容体を選択し,新規に細胞膜透過性の合成小分子プローブMGIP_3/PMをデザイン・合成した.デザインにはリン酸基と蛋白質の静電相互作用の他,ソフトな分子間相互作用を行うため色素分子が疎水性相互作用によって標的分子と親和性を持つようにデザインした.次にMGIP_3/PMをロードした細胞にレーザーを照射し,IP_3を産生する刺激を行った.レーザーの当たっていない細胞では,IP_3によりCa^<2+>オシレーションが起き正常な細胞応答を示したが,レーザーの当たった細胞ではCa^<2+>応答が大きく抑制され,生理的な条件でCALIを行うことができることが示された.次に,用いた細胞(DT40)条件においてIP_3受容体の関与が示唆されている,細胞外からのCa^<2+>流入(capacitative Ca^<2+> entry, CCE)を誘導した.その結果,CCEにはCALIの効果は現れなかった。この結果からIP_3受容体の活性化はCCE機構に関与しないことが示唆された.

使用各种方法（例如分子生物学，药理学和生物化学）进行灭活靶分子的研究有效阐明生物分子，但其中，其中，染色体辅助激光失活：Cali）引起了注意，因为它允许在时间和空间中严格控制灭活。 CALI是一种抗体或配体的方法，染料与该抗体或配体结合到细胞中，与靶分子结合，然后激光辐照共轭物，从染料中灭活的自由基。卡利的优势是它可以在特定的时间和地点灭活，但是由于使用抗体来识别靶分子，因此很难细胞内引入，并且在生理条件下很难应用。因此，目的是开发一种方法，该方法允许开发一种方法，该方法允许细胞在不磨细胞的情况下特异性地使靶分子灭活。作为CALI的靶分子，我们选择了一个主要调节细胞内Ca^<2+>动力学的肌醇3-磷酸（IP_3）受体，并设计和合成了新的可渗透细胞膜的合成小分子探针MGIP_3/PM。除了磷酸基团与蛋白质之间的静电相互作用外，色素分子还设计为通过疏水相互作用具有与靶分子的亲和力。接下来，我们将激光应用于装有MGIP_3/pm的单元格。进行辐照以产生IP_3。在不暴露于激光器的细胞中，Ca^<2+>振荡发生在IP_3中并显示出正常的细胞反应，但是在暴露于激光器的细胞中，CA^<2+>反应受到了显着抑制，表明CALI可以在生理条件下进行。接下来，提出了IP_3受体在细胞中的参与（DT40）条件，并从外部从细胞中涌入电容性Ca^<2+>涌入。诱导Ca^<2+>进入，CCE）。结果，卡利对CCE没有任何影响。这些结果表明，IP_3受体的激活不参与CCE机制。