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核膜を介した双方向輸送に関わる蛋白質の多様な相互作用の構造生物学的研究

参与跨核膜双向运输的蛋白质各种相互作用的结构生物学研究

基本信息

批准号：
16048225
负责人：
山縣ゆり子
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

熊本大学谷らによって酵母のmRNAの核外輸送ができない温度感受性株の一つの原因蛋白質として見出されたPtr7はATP/GTP結合モチーフをもつ酵母の生育に必須の新規蛋白質で、核膜を介した核と細胞質間の双方向の輸送に必須であることが示されている。こ本研究の目的は、この新たに見出されたPtr7のX線結晶構造解析を行い、核膜孔複合体因子の一部に見られ、輸送に関わる蛋白質と相互作用するFGリピート領域と同様の配列をもつ意味やヒトPtr7と相互作用すると考えられている幾つかの蛋白質との核膜を介したソフトな相互作用を解明することである。本年度の成果は以下の通りである。1.現在、Ptr7蛋白質の最も有望な大量産生系は封入体として生じる蛋白質を6M尿素で可溶化後、透析法でゆっくり尿素の濃度を薄くして行くことによって、蛋白質のリフォールディングを行い、大腸菌1リットルの培養で数100μgの蛋白質が得られる条件である。大腸菌の培養量を増やしてより大量に精製するという方向で精製を行った。Prt7蛋白質を精製する都度、結晶が得られた沈殿剤にPEG6000を用いた条件を中心にしつつ、広範な条件の結晶化のスクリーニングを行い、X線解析に適した結晶の調製に取り組んだ。2.合わせてより効率のよいリフォールデリング条件の検索を、主に添加物を加えて検討したが、現在のところ今以上に効率よく精製できる条件は見つかっていない。1の方法でPtr7の精製を行う一方、平行して、可溶性でより大量に得られる発現系の構築のため、種々の発現ベクターや大腸菌宿主を用いて、培養条件(温度、誘導方法、時間など)を検討した。現在のところpBluescrpt系とp ET系ベクターをもとに独自に作成した発現ベクターを用いたものが有望と思われる。

Kumamoto University-Taniya Taniya The purpose of this study is to find out the X-ray crystal structure analysis of Ptr7 and to clarify the protein interaction between Ptr7 and Ptr7 in the nuclear membrane pore complex. The results of this year are as follows: 1. At present, Ptr7 protein is most likely to be produced in large quantities in the presence of encapsulated protein in 6M urea, solubilized in urea, dialyzed in low urea concentration, protein isolated in Escherichia coli, cultured in 100μg of protein. The amount of coliform culture is increased and the direction of purification is improved. Prt7 protein purification, crystallization, precipitation, PEG6000, application conditions, center conditions, crystallization conditions, X-ray analysis, crystallization, modulation, composition. 2. In addition, the main additive can be added to the effective rate. 1. Methods for purification of Ptr7 were discussed in terms of side, parallel, soluble, high yield, construction of development system, seed development, use of E. coli host, culture conditions (temperature, induction method, time). Now, the Bluescrpt system is designed to be used independently.

项目成果

期刊论文数量（14）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Optimal site-specific PEGylation of mutant TNF-alpha improves its antitumor potency.

突变体 TNF-α 的最佳位点特异性聚乙二醇化可提高其抗肿瘤效力。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Biochem.Biophys.Res.Commun. 315・4
影响因子：
0
作者：
Yoshioka Y.;et al.
通讯作者：
et al.

タンパク質のかたちから生命の謎を解く

从蛋白质的形状解开生命之谜

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
影响因子：
0
作者：
Lee S.J.et al.;Tsunaka Y. et al.;Yoshioka Y. et al.;Hioki Y. et al.;Mishima M. et al.;Nakamura T. et al.;Shibata H. et al.;田之倉優編;田之倉優編
通讯作者：
田之倉優編

Structure of human MTH1, a nudix family hydrolase that selectively degrades oxidized purine nucleoside triphosphates