マウスES細胞の細胞周期因子制御と未分化性維持機構の解析

小鼠ES细胞细胞周期因子调控及未分化维持机制分析

基本信息

批准号：
17045040
负责人：
正井久雄
金额：
$ 3.33万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

未分化マウス胚性幹細胞(以下ES細胞)の細胞周期進行は、分化細胞のそれとは際立って異なる。増殖サイクルは10時間程であり、大部分S期とM期からなり、G1期とG2期は大変短い。ES細胞の自己複製はこのような特徴的な細胞周期進行の上になりたっており、未分化能の維持も細胞周期制御と関連していると考えられているが、その分子基盤に関する研究は少ない。我々は、未分化マウスES細胞と胚性繊維芽細胞とにおいて、種々の複製因子および細胞周期制御因子の発現レベルを比較した結果、ES細胞ではCdc6(M期終期に複製準備複合体の形成に必須)、ASK(Cdc7キナーゼの活性化サブユニット;S期の開始と進行に必須)、CyclinA(S期からG2/Mへの移行に必須)およびCyclinB(M期の開始に必須)の4つのタンパク質が大量発現していることを見出した。また、これらの因子の発現量は、ES細胞の分化誘導に伴い急速に低下した。以上の結果から、これらの複製制御因子の協調的な大量発現により未分化ES細胞に特有の細胞周期制御が支持される可能性が示唆された。体細胞の細胞周期においてCdc6はG1期初期にユビキチンリガーゼAPC/Cdh1を介したタンパク質分解を受けるが、ES細胞では細胞周期を通じて安定に保たれる。我々は、ES細胞ではAPC/Cdh1の活性阻害因子であるEmi1が大量発現しており、その発現レベルは分化誘導により急激に低下することを見い出した。Emi1の転写制御領域にはE2F転写因子結合部位が複数個存在し、そのプロモーター活性はE2F1-3により顕著に活1生化される。プロモーターの変異解析から一方、未分化細胞ではE2Fが促進的な複合体を形成するが、分化誘導により抑制型の複合体に変換されることが明らかとなった。Emi1をsiRNAでノックダウンすると、CyclinA, BおよびGemininなどの発現量が低下するがCdc6は変化しない。このことからCdc6とこれらの因子はタンパクレベルで異なる制御をうけている可能性が示唆された。Emi1の大量発現がES細胞の分化誘導にどのような影響を与えるかにっいて現在検討している。また、これらの因子の細胞周期変動について、蛍光タンパクとの融合分子を用いて解析している。

未分化的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）的细胞周期进程与分化细胞的细胞周期进程明显不同。增殖周期约为10小时，大部分为S和M相，而G1和G2相非常短。 ES细胞的自我更新已成为这种特征细胞周期发展的因素，尽管维持未分化的潜力也被认为与细胞周期调节有关，但对其分子基础的研究很少。我们比较了未分化的小鼠ES细胞和胚胎成纤维细胞中各种复制和细胞周期调节剂的表达水平，发现在ES细胞中表达了四种蛋白质：Cdc6：Cdc6（对于在M期结束时形成复制制备复制复合物必不可少的必不可少） G2/M）和Cyclinb（对于M相启动至关重要）。此外，由于ES细胞的诱导诱导，这些因素的表达水平迅速降低。以上结果表明，这些复制调节剂的大量表达可能支持未分化的ES细胞独有的细胞周期调节。在体细胞的细胞周期中，CDC6在G1早期通过泛素连接酶APC/CDH1进行蛋白水解，但在ES细胞中的整个细胞周期中保持稳定。我们发现，APC/CDH1活性的抑制剂EMI1在ES细胞中表达，其突然降低的表达水平是由于分化诱导而降低的。 EMI1的转录调节区域包含多个E2F转录因子结合位点，其启动子活性被E2F1-3显着激活。另一方面，对启动子的突变分析表明，E2F在未分化的细胞中形成启动子复合物，但通过诱导分化将其转化为抑制性复合物。用siRNA击倒EMI1会降低Cyclina，B和Gexinin的表达水平，但CDC6不会改变。这表明CDC6和这些因素可能在蛋白质水平上受到不同的对照。我们目前正在研究EMI1的高表达如何影响ES细胞分化的诱导。此外，使用与荧光蛋白融合的分子分析这些因素的细胞周期波动。