停止複製フォーク結合タンパク質PriAを用いた染色体脆弱部位の探索

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本研究では、大腸菌PriAタンパク質の「停止した複製フォークに選択的に強く結合する」という生化学的性質をtoolとして、複製が停止しやすいあるいはslow downする染色体脆弱部位を染色体上の複製が停止し易い領域あるいは、停止した際に適切に回復さない領域として網羅的に探索することを計画した。動物細胞(がん細胞あるいは正常細胞)でPriAタンパクを発現し、正常に複製している状態あるいは低濃度のaphidicolinあるいはHU(ヒドロキシ尿素:複製阻害剤)で複製進行を阻害した場合にPriAタンパク質が結合するDNAを染色体免疫沈降法で濃縮し、同定する。期間内に、このシステムを構築し、複製停止部位をゲノムワイドで同定する。種々のヒト細胞でtag付きPriAをectopicに発現する細胞株を樹立し、tagに対する抗体を用いた染色体免疫沈降法により、沈降されるDNAを濃縮、増幅し、ゲノムタイリングアレイへのhybridizationあるいは網羅的塩基配列決定により、複製フォークの停止し易い領域をゲノムワイドで同定する計画である。本年度の成果は以下の通りである。1 作製したPriAに対する特異抗体および付加したtagに対する抗体により、様々な細胞(ヒトがん細胞および正常細胞)に発現したPriAを免疫沈降できることを確認した。また、クロスリンクによる染色体免疫沈降条件下でも解析可能な効率で免疫沈降できることを確認した。マイクロアレイ解析に持ち込める染色体を沈降させるための条件検討を重ね、最適条件を決定した。2 まず大腸菌をもちいて、染色体免疫沈降を行い、マイクロアレイによる検出を試みた。コントロールとして、PriA欠損株のほか、複製起点や複製中のフォークに存在するDnaBなど、複製装置を構成するタンパク質を利用した。これらの大腸菌のゲノム上に検出される各ピークの解析において、既存のソフトウェアでは結合イベントの妥当性を正確に見積もれなかったため、専用のアルゴリズムを作製し、現在検証中である。