停止複製フォーク結合タンパク質PriAを用いた染色体脆弱部位の探索

使用停滞复制叉结合蛋白 PriA 搜索染色体脆弱位点

• 批准号: 21657036
• 负责人: 正井 久雄
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2009 至 2010
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21657036/
• 关键词: PriAタンパク; 複製フォーク; 染色体脆弱部位; 染色体免疫沈降; aphidicolin; ChIP-chip解析; DNA複製停止; DNAヘリカーゼ

本研究では、大腸菌PriAタンパク質の「停止した複製フォークに選択的に強く結合する」という生化学的性質をtoolとして、複製が停止しやすいあるいはslow downする染色体脆弱部位を染色体上の複製が停止し易い領域あるいは、停止した際に適切に回復さない領域として網羅的に探索することを計画した。動物細胞(がん細胞あるいは正常細胞)でPriAタンパクを発現し、正常に複製している状態あるいは低濃度のaphidicolinあるいはHU(ヒドロキシ尿素:複製阻害剤)で複製進行を阻害した場合にPriAタンパク質が結合するDNAを染色体免疫沈降法で濃縮し、同定する。期間内に、このシステムを構築し、複製停止部位をゲノムワイドで同定する。種々のヒト細胞でtag付きPriAをectopicに発現する細胞株を樹立し、tagに対する抗体を用いた染色体免疫沈降法により、沈降されるDNAを濃縮、増幅し、ゲノムタイリングアレイへのhybridizationあるいは網羅的塩基配列決定により、複製フォークの停止し易い領域をゲノムワイドで同定する計画である。本年度の成果は以下の通りである。1 作製したPriAに対する特異抗体および付加したtagに対する抗体により、様々な細胞(ヒトがん細胞および正常細胞)に発現したPriAを免疫沈降できることを確認した。また、クロスリンクによる染色体免疫沈降条件下でも解析可能な効率で免疫沈降できることを確認した。マイクロアレイ解析に持ち込める染色体を沈降させるための条件検討を重ね、最適条件を決定した。2 まず大腸菌をもちいて、染色体免疫沈降を行い、マイクロアレイによる検出を試みた。コントロールとして、PriA欠損株のほか、複製起点や複製中のフォークに存在するDnaBなど、複製装置を構成するタンパク質を利用した。これらの大腸菌のゲノム上に検出される各ピークの解析において、既存のソフトウェアでは結合イベントの妥当性を正確に見積もれなかったため、専用のアルゴリズムを作製し、現在検証中である。

This study で は, coliform PriA タ ン パ ク qualitative の "stop し た copy フ ォ ー ク に sentaku に strong く combined す る" と い う biochemical properties を tool と し て, duplicate が stop し や す い あ る い は missile Down す る chromosome fragile site を の replicated chromosomes が stop し い domains あ る い は, stop し た interstate に appropriate reply に さ な い field と し て snare に explore す る こ と を project し た. Animal cells (が ん cells あ る い は normal cells) で PriA タ ン パ ク を 発 に し, abnormal し て い る state あ る い は low concentration の aphidicolin あ る い は HU (ヒ ド ロ キ シ urea: copy resistance against tonic) で replication を resistance against し た occasions に PriA タ ン パ ク qualitative が combining す る を chromosome DNA immune shen The process of で concentration する and equalization する. During this period, に, <s:1> システムを construct システムを, replicate the stop site をゲノムワ ドで ドで fix する. Kind of 々 の ヒ ト cells で tag pay き PriA を ectopic に 発 now す る cell lines を し, tag に す seaborne を る antibody with い た chromosome immune sink method に よ り, sink さ れ る DNA を enrichment, raised し, ゲ ノ ム タ イ リ ン グ ア レ イ へ の hybridization あ る い は snare salt base with column decided に よ Youdaoplaceholder1, copy フォ, フォ,, stop the をゲノムワ, をゲノムワ, ドで and formulate the する plan である. The <s:1> achievements of this year are as follows: である である. 1 the system し た PriA に す seaborne る specific antibodies お よ び plus し た tag に す seaborne る antibody に よ り, others 々 な cells (ヒ ト が ん cells お よ び normal cells) に 発 now し た PriA を immune sink で き る こ と を confirm し た. ま た, ク ロ ス リ ン ク に よ る chromosome immune sink conditions で も parsing may な sharper rate で immune sink で き る こ と を confirm し た. マ イ ク ロ ア レ イ parsing に hold ち 込 め る chromosome を sink さ せ る た め の beg を 検 ね, the optimum condition を decided し た. 2 ま ず coliform を も ち い て, chromosome immune sink を い, マ イ ク ロ ア レ イ に よ る 検 try out を み た. コ ン ト ロ ー ル と し て, PriA owe damage strain の ほ か, copying beginning や copy の フ ォ ー ク に exist す る DnaB な ど, reproduction device を constitute す る タ ン パ ク を using し た. On こ れ ら の coliform の ゲ ノ ム に 検 out さ れ る each ピ ー ク の parsing に お い て, existing の ソ フ ト ウ ェ ア で は combining イ ベ ン ト の justice を に see right product も れ な か っ た た め, 専 の ア ル ゴ リ ズ ム を cropping し, now 検 certificate in で あ る.

项目成果

S期開始,進行の制御と疾患.炎症と免疫

S期开始、进展和疾病的控制。

• 发表时间: 2009
• 作者: Sasanuma;H.;Hirota;K.;Fukuda;T.;Kakusho;N.;Kugou;N.;Kawasaki;Y.;Shibata;T.;Masai;H. and Ohta;K.;正井久雄
• 通讯作者: 正井久雄

染色体サイクルの連係的制御機構概論蛋白質核酸酵素増刊号「染色体サイクル」

染色体循环耦合调控机制综述蛋白质、核酸、酶特刊“染色体循环”

• 发表时间: 2009
• 作者: Sakaue-Sawano;A.;Kurokawa;H.;Morimura;T.;Hanyu;A.;Hama;H.;Kashiwagi;S.;Fukami;K.;Imamura;T.;Ogawa;M.;Masai;H. and Miyawaki;A.;太田邦史;正井久雄
• 通讯作者: 正井久雄

Molecular mechanism of activation of human Cdc7 kinase : Bipartite interaction with Dbf4/ASK stimulates ATP binding and substrate recognition.

人 Cdc7 激酶激活的分子机制：与 Dbf4/ASK 的双向相互作用刺激 ATP 结合和底物识别。

• 发表时间: 2011
• 期刊: J.Biol.Chem. (In press)
• 作者: Ryo Kitamura;Rino Fukatsu;Naoko Kakusho;Yong-Soon Cho;Chika Taniyama;Satoshi Yamazaki;Gaik-theng Toh;Kazuo Yanagi;Naoko Arai;Ho-Jin Chang;Hisao Masai
• 通讯作者: Hisao Masai

Cell cycle regulation of embryonic stem cells regulating the maintenance of pluripotency and differentiation.

胚胎干细胞的细胞周期调节调节多能性和分化的维持。

• 发表时间: 2010
• 作者: Masai;H.;Fujii;H.;Kanoh;Y.;Kakusho;N.;Ito;S.;Sawano;A.;Miyawaki;A.
• 通讯作者: A.

Factors Regulating the Origin Selection in Eukaryotic DNA Replication.

真核 DNA 复制中调控起源选择的因素。

• 发表时间: 2009
• 作者: Masai;H.;Matsumoto;S.;Hayano;M.;Kanoh;Y.;Yamazaki;S.;Shimmoto;M.;Kakusho;N.;Kudo;S.
• 通讯作者: S.