停止複製フォーク結合タンパク質PriAを用いた染色体脆弱部位の探索

使用停滞复制叉结合蛋白 PriA 搜索染色体脆弱位点

基本信息

批准号：
21657036
负责人：
正井久雄
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、大腸菌PriAタンパク質の「停止した複製フォークに選択的に強く結合する」という生化学的性質をtoolとして、複製が停止しやすいあるいはslow downする染色体脆弱部位を染色体上の複製が停止し易い領域あるいは、停止した際に適切に回復さない領域として網羅的に探索することを計画した。動物細胞(がん細胞あるいは正常細胞)でPriAタンパクを発現し、正常に複製している状態あるいは低濃度のaphidicolinあるいはHU(ヒドロキシ尿素:複製阻害剤)で複製進行を阻害した場合にPriAタンパク質が結合するDNAを染色体免疫沈降法で濃縮し、同定する。期間内に、このシステムを構築し、複製停止部位をゲノムワイドで同定する。種々のヒト細胞でtag付きPriAをectopicに発現する細胞株を樹立し、tagに対する抗体を用いた染色体免疫沈降法により、沈降されるDNAを濃縮、増幅し、ゲノムタイリングアレイへのhybridizationあるいは網羅的塩基配列決定により、複製フォークの停止し易い領域をゲノムワイドで同定する計画である。本年度の成果は以下の通りである。1 作製したPriAに対する特異抗体および付加したtagに対する抗体により、様々な細胞(ヒトがん細胞および正常細胞)に発現したPriAを免疫沈降できることを確認した。また、クロスリンクによる染色体免疫沈降条件下でも解析可能な効率で免疫沈降できることを確認した。マイクロアレイ解析に持ち込める染色体を沈降させるための条件検討を重ね、最適条件を決定した。2 まず大腸菌をもちいて、染色体免疫沈降を行い、マイクロアレイによる検出を試みた。コントロールとして、PriA欠損株のほか、複製起点や複製中のフォークに存在するDnaBなど、複製装置を構成するタンパク質を利用した。これらの大腸菌のゲノム上に検出される各ピークの解析において、既存のソフトウェアでは結合イベントの妥当性を正確に見積もれなかったため、専用のアルゴリズムを作製し、現在検証中である。

在这项研究中，我们计划全面寻找容易停止大肠杆菌的复制叉，作为一种工具的复制叉的染色体脆弱地点，并探索染色体脆弱的地点，易受伤害的地点容易停止或放慢，因为染色体的染色体区域是在染色体上，这些染色体是在染色体上不得不恢复后停止的染色体。当动物细胞（癌细胞或正常细胞）表达PRIA蛋白并用正常复制或低浓度的蚜虫或HU（羟基脲：复制抑制剂）抑制复制进展时，PRIA蛋白与之结合的DNA被浓缩并被浓浓度通过染色体免疫原子化。在一段时间内，构建了系统，并确定了整个基因组的复制停滞位点。该计划是建立在各种人类细胞中表达标记的PRIA的细胞系，通过使用抗体对标签的抗体来富集并扩大降水的DNA，并确定可能通过杂交将基因组平面阵列中的复制叉停止复制的基因组区域。今年的结果如下：1证实，可以通过在各种细胞（人类癌细胞和正常细胞）上表达的免疫沉淀PRIA来免疫沉淀的针对PRIA的特异性抗体和针对添加标签的抗体。此外，即使在通过交联的染色体免疫沉淀条件下，也可以通过有效分析进行免疫沉淀。重复最佳条件，以确定可以将染色体的沉淀物的沉积物进行到微阵列分析中。 2首先，大肠杆菌用于进行染色体免疫沉淀，并尝试通过微阵列进行检测。作为对照，使用了构成复制装置的蛋白质，例如缺乏PRIA的菌株以及复制叉中存在的DNAB。在大肠杆菌基因组上检测到的每个峰的分析中，现有软件没有准确估计结合事件的有效性，因此创建了专用算法并正在验证。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Bacterial primosome.

细菌初染色体。

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
Encyclopedia of Life Sciences
影响因子：
0
作者：
Tanaka;T.;Masai;H.
通讯作者：
H.

Cell Cycle and Mitosis.

细胞周期和有丝分裂。

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
Masai;H.: 2010.11.24-30;RIKEN Yokohama;Japan
通讯作者：
Japan

Cell cycle regulation of embryonic stem cells regulating the maintenance of pluripotency and differentiation.

胚胎干细胞的细胞周期调节调节多能性和分化的维持。

DOI：
发表时间：
2010
期刊：
影响因子：
0
作者：
Masai;H.;Fujii;H.;Kanoh;Y.;Kakusho;N.;Ito;S.;Sawano;A.;Miyawaki;A.
通讯作者：
A.

Cdc7L1.

CDC7L1。

DOI：
发表时间：
2011
期刊：
UCSD-Nature Molecule Pages (in press (Review))
影响因子：
0
作者：
Toh G-T.;Masai;H.
通讯作者：
H.

Deregulated Cdc6 inhibits DNA replication and suppresses Cdc7-mediated phosphorylation of Mcm2-7 complex.

DOI：
10.1093/nar/gkq262
发表时间：
2010-09
期刊：
Nucleic acids research
影响因子：
14.9
作者：
Kundu LR;Kumata Y;Kakusho N;Watanabe S;Furukohri A;Waga S;Seki M;Masai H;Enomoto T;Tada S
通讯作者：
Tada S