On-grid biochemistry: Structural analyses of G-quadruplex-telomere factor complexes

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当初、G4（グアニン四重鎖）DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指し、マウスRif1（2,418アミノ酸）、及び分裂酵母Rif1（1,400アミノ酸）の大量精製に着手した。しかし、両者とも全長タンパク質として大量精製することは非常に困難であった。そこで、ヒトRif1の精製を試みた。monoQカラムなどと組み合わせ、比較的濃度の高い標品を得ることができた。マウスRif1についてN末端領域（NTD, 1,151アミノ酸）とC 末端領域（CTD, 299アミノ酸）の間にある長い天然変性領域（LID, 968アミノ酸）を欠失させたRif1-NC（NTD+CTD）を293T細胞から大量精製した。また、ヒトRif1-NCの精製を進めた。Huilin Li 教授のラボでこれらの電顕観察・単粒子解析を実施している。また、これらの標品を用い高速AFMによりその分子動態を解析した。N末端92アミノ酸を欠失させた分裂酵母のRif1を精製し、現在Huilin Li 教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進めている。分裂酵母及びヒトRif1のC末端領域ポリペプチドのみでテトラマー（四量体）を形成し、G4にも結合する。これらのポリペプチドを大腸菌で大量精製し、Cryo観察やAFM解析を行った。