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On-grid biochemistry: Structural analyses of G-quadruplex-telomere factor complexes

在线生物化学：G-四链体-端粒因子复合物的结构分析

基本信息

批准号：
20KK0157
负责人：
正井久雄
金额：
$ 11.98万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-10-27 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

当初、G4（グアニン四重鎖）DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指し、マウスRif1（2,418アミノ酸）、及び分裂酵母Rif1（1,400アミノ酸）の大量精製に着手した。しかし、両者とも全長タンパク質として大量精製することは非常に困難であった。そこで、ヒトRif1の精製を試みた。monoQカラムなどと組み合わせ、比較的濃度の高い標品を得ることができた。マウスRif1についてN末端領域（NTD, 1,151アミノ酸）とC 末端領域（CTD, 299アミノ酸）の間にある長い天然変性領域（LID, 968アミノ酸）を欠失させたRif1-NC（NTD+CTD）を293T細胞から大量精製した。また、ヒトRif1-NCの精製を進めた。Huilin Li 教授のラボでこれらの電顕観察・単粒子解析を実施している。また、これらの標品を用い高速AFMによりその分子動態を解析した。N末端92アミノ酸を欠失させた分裂酵母のRif1を精製し、現在Huilin Li 教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進めている。分裂酵母及びヒトRif1のC末端領域ポリペプチドのみでテトラマー（四量体）を形成し、G4にも結合する。これらのポリペプチドを大腸菌で大量精製し、Cryo観察やAFM解析を行った。

At the beginning, it was decided that the microscopic form of the G4 (Armen Quadruple Lock) DNA and the full-length Rif1 Arima complex should be analyzed using an electron microscope and single particle analysis. It is a large-scale purification process of することを目し, マウスRif1 (2,418 アミノ acid), and fission yeast Rif1 (1,400 アミノ acid).しかし、両者ともFull length タンパクquality としてRefined in large quantities することはVery difficult であった.そこで、ヒトRif1のRefinedをtrialみた. The monoQ カラムなどと group み合わせ, the comparative concentration の高いstandard product を得ることができた.マウスRif1についてN terminal domain (NTD, 1,151 アミノ acid) and C terminal domain (CTD, 299 アミノ acid) の间にある长いnaturally changing domain (LID, 968アミノAcid)を无码させたRif1-NC (NTD+CTD)を293T cells are refined in large quantities.また, ヒトRif1-NC's refined をjinめた. Professor Huilin Li is a professor of electromagnetic field observation and single particle analysis. The standard products are analyzed using high-speed AFM for molecular dynamics analysis. The N-terminal 92 アミノをををさせたRif1 of fission yeast was refined, and now Professor Huilin Li is conducting electrochemical observation and single particle analysis. The C-terminal domain of fission yeast and Rif1 is formed and G4 is combined.これらのポリペプチドをEscherichia coli でRefined in large quantities, Cryo Observation やAFM analysis を行った.

项目成果

期刊论文数量（60）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

ゲノムに潜む未解明のシグナル、グアニン４重鎖（実験医学増刊号「セントラルドグマの新常識」）

鸟嘌呤四联体，隐藏在基因组中的无法解释的信号（实验医学特刊《中心法则新常识》）

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
正井久雄 ; 田中卓 ;鷺朋子 ;深津理乃 ;関由美香;正井　久雄
通讯作者：
正井　久雄

Association of Rif1 with nuclear membrane is essential for genome-wide replication timing regulation.

Rif1 与核膜的关联对于全基因组复制计时调节至关重要。

DOI：
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
0
作者：
Hisao Masai;Yuraka Kanoh;Rino Fukatsu;Seiji Matsumoto;Shunsuke Kobayashi;Hiroyuki Kato;Asami Oji;Sayuri Ito;Naoko Kakusho;Kenji Mariyama;Ichiro Hiratani;Naoko Yoshizawa
通讯作者：
Naoko Yoshizawa

Roles of G4 binding and multimization of Rif1 in S phase regulation in fission yeast cells.

G4 结合和 Rif1 多重化在裂殖酵母细胞 S 期调节中的作用。

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
Hisao Masai;Yutaka Kanoh;Kaho Takasawa;Daisuke Koida;Seiji Matsumoto
通讯作者：
Seiji Matsumoto

Claspin, a key regulator of replication checkpoint, is differentially regulated in cancer and non-cancer cells.

Claspin 是复制检查点的关键调节因子，在癌细胞和非癌细胞中受到不同的调节。

DOI：
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
0
作者：
Hiroyuki Sasanuma;Kousei Yamada;Ngo Trinh;Hisao Masai;Kosuke Yusa;Chi-Chun Yang and Hisao Masai
通讯作者：
Chi-Chun Yang and Hisao Masai

Chromatin regulation that involves assembly of protein, lipid, and DNA with a special higher-order structure

染色质调控涉及蛋白质、脂质和具有特殊高阶结构的 DNA 的组装