On-grid biochemistry: Structural analyses of G-quadruplex-telomere factor complexes

在线生物化学：G-四链体-端粒因子复合物的结构分析

基本信息

批准号：
20KK0157
负责人：
正井久雄
金额：
$ 11.98万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-10-27 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

当初、G4（グアニン四重鎖）DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指し、マウスRif1（2,418アミノ酸）、及び分裂酵母Rif1（1,400アミノ酸）の大量精製に着手した。しかし、両者とも全長タンパク質として大量精製することは非常に困難であった。そこで、ヒトRif1の精製を試みた。monoQカラムなどと組み合わせ、比較的濃度の高い標品を得ることができた。マウスRif1についてN末端領域（NTD, 1,151アミノ酸）とC 末端領域（CTD, 299アミノ酸）の間にある長い天然変性領域（LID, 968アミノ酸）を欠失させたRif1-NC（NTD+CTD）を293T細胞から大量精製した。また、ヒトRif1-NCの精製を進めた。Huilin Li 教授のラボでこれらの電顕観察・単粒子解析を実施している。また、これらの標品を用い高速AFMによりその分子動態を解析した。N末端92アミノ酸を欠失させた分裂酵母のRif1を精製し、現在Huilin Li 教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進めている。分裂酵母及びヒトRif1のC末端領域ポリペプチドのみでテトラマー（四量体）を形成し、G4にも結合する。これらのポリペプチドを大腸菌で大量精製し、Cryo観察やAFM解析を行った。

最初，我们开始对小鼠RIF1（2,418个氨基酸）和裂变酵母RIF1（1,400氨基酸）进行质量纯化，目的是确定G4（鸟嘌呤四倍体）DNA的精细形态（Guanine Quadruplex）DNA和全长长度RIF1寡聚物，由Cryo-Electron Miroccopy。但是，两者都难以纯化大量的全长蛋白。因此，人类RIF1试图净化它。通过将其与Monoq柱组合，可以获得相对较高的样品。从N-末端区域（NTD，1,151氨基酸）和C-末端区域（CTD，299氨基酸）之间纯化RIF1-NC（NTD+CTD）从具有长，天然变性区域（LID，968个氨基酸）的293T细胞纯化。此外，人类RIF1-NC被纯化。这些电子显微镜观测和单个粒子分析正在Huilin Li的实验室中进行。此外，这些标本用于使用高速AFM分析其分子动力学。 RIF1是一种从N末端92氨基酸中删除的裂变酵母，已被纯化，目前在Huilin Li的实验室中进行了电子显微镜观察和单个颗粒分析。只有人RIF1的裂变酵母和C末端区域多肽形成四聚体（四聚体）并与G4结合。这些多肽在大肠杆菌中大量纯化，并进行冷冻观察和AFM分析。

项目成果

期刊论文数量（60）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

ゲノムに潜む未解明のシグナル、グアニン４重鎖（実験医学増刊号「セントラルドグマの新常識」）

鸟嘌呤四联体，隐藏在基因组中的无法解释的信号（实验医学特刊《中心法则新常识》）

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
正井久雄 ; 田中卓 ;鷺朋子 ;深津理乃 ;関由美香;正井　久雄
通讯作者：
正井　久雄

Claspin, a key regulator of replication checkpoint, is differentially regulated in cancer and non-cancer cells.

Claspin 是复制检查点的关键调节因子，在癌细胞和非癌细胞中受到不同的调节。

DOI：
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
0
作者：
Hiroyuki Sasanuma;Kousei Yamada;Ngo Trinh;Hisao Masai;Kosuke Yusa;Chi-Chun Yang and Hisao Masai
通讯作者：
Chi-Chun Yang and Hisao Masai

Roles of G4 binding and multimization of Rif1 in S phase regulation in fission yeast cells.

G4 结合和 Rif1 多重化在裂殖酵母细胞 S 期调节中的作用。