On-grid biochemistry: Structural analyses of G-quadruplex-telomere factor complexes

在线生物化学：G-四链体-端粒因子复合物的结构分析

• 批准号: 20KK0157
• 负责人: 正井 久雄
• 金额: $ 11.98万
• 依托单位: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-10-27 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20KK0157/
• 关键词: Rif1; オリゴマー; グアニン四重鎖; 電子顕微鏡; 単粒子解析; クロマチンループ; テロメア; シェルタリン; グアニン４重鎖; クライオ電顕; G-quadruplexes

当初、G4（グアニン四重鎖）DNAと全長Rif1オリゴマーとの複合体の微細形態をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で決定することを目指し、マウスRif1（2,418アミノ酸）、及び分裂酵母Rif1（1,400アミノ酸）の大量精製に着手した。しかし、両者とも全長タンパク質として大量精製することは非常に困難であった。そこで、ヒトRif1の精製を試みた。monoQカラムなどと組み合わせ、比較的濃度の高い標品を得ることができた。マウスRif1についてN末端領域（NTD, 1,151アミノ酸）とC 末端領域（CTD, 299アミノ酸）の間にある長い天然変性領域（LID, 968アミノ酸）を欠失させたRif1-NC（NTD+CTD）を293T細胞から大量精製した。また、ヒトRif1-NCの精製を進めた。Huilin Li 教授のラボでこれらの電顕観察・単粒子解析を実施している。また、これらの標品を用い高速AFMによりその分子動態を解析した。N末端92アミノ酸を欠失させた分裂酵母のRif1を精製し、現在Huilin Li 教授のラボで電顕観察・単粒子解析を進めている。分裂酵母及びヒトRif1のC末端領域ポリペプチドのみでテトラマー（四量体）を形成し、G4にも結合する。これらのポリペプチドを大腸菌で大量精製し、Cryo観察やAFM解析を行った。

At the beginning, G4 (グ ア ニ ン fourfold lock) DNA length と Rif1 オ リ ゴ マ ー と の complex の micro morphological を ク ラ イ オ electronic 顕 micromirror に よ る 単 particle analytical で decided す る こ と を refers し, マ ウ ス Rif1 (2418 ア ミ ノ acid), and yeast び split Rif1 (1400 ア ミ ノ acid) の lots of refined に to し た. し か し, struck と も span タ ン パ ク qualitative と し て lots of refined す る こ と は very difficult に で あ っ た. Youdaoplaceholder0 で で, ヒトRif1 μ m refined を test みた. The monoQカラムな と と group み combined わせ and compared the concentration of the <s:1> high <s:1> standard substance を る る とがで た た た た た. マ ウ ス Rif1 に つ い て N terminal area (NTD, 1151 ア ミ ノ acid) と C terminal domain (CTD, 299 ア ミ ノ acid) between の に あ る long い - natural areas (LID, 968 ア ミ ノ acid) lost を owe さ せ た Rif1 - NC + CTD (NTD) を 293 t cells か ら lots of refined し た. Youdaoplaceholder0, ヒトRif1-NC <s:1> refined を into めた. Professor Huilin Li ラボで ラボで れら れら <s:1> electric 顕観 observation · 単 particle resolution を implementation て る る る. The また and <s:1> れら standard products を are analyzed by <s:1> high-speed AFMによ そ <s:1> molecular dynamics を to determine た. N at the end of 92 ア ミ ノ acid を owe lost さ せ た split yeast の Rif1 を refined し, now professor Huilin Li の ラ ボ で electric 顕 観 examine, analytical を 単 particles into め て い る. Split yeast and び ヒ ト Rif1 の C terminal areas ポ リ ペ プ チ ド の み で テ ト ラ マ ー (four quantity body) を form し, G4 に も combining す る. Youdaoplaceholder6 れら ポリペプチドを escherichia coli で large quantity refined <s:1> Cryo観 observe やAFM analysis を line った.

项目成果

ゲノムに潜む未解明のシグナル、グアニン４重鎖（実験医学増刊号「セントラルドグマの新常識」）

鸟嘌呤四联体，隐藏在基因组中的无法解释的信号（实验医学特刊《中心法则新常识》）

• 发表时间: 2022
• 作者: 正井 久雄 ; 田中 卓 ;鷺 朋子 ;深津 理乃 ;関 由美香;正井 久雄
• 通讯作者: 正井 久雄

Association of Rif1 with nuclear membrane is essential for genome-wide replication timing regulation.

Rif1 与核膜的关联对于全基因组复制计时调节至关重要。

• 发表时间: 2019
• 作者: Hisao Masai;Yuraka Kanoh;Rino Fukatsu;Seiji Matsumoto;Shunsuke Kobayashi;Hiroyuki Kato;Asami Oji;Sayuri Ito;Naoko Kakusho;Kenji Mariyama;Ichiro Hiratani;Naoko Yoshizawa
• 通讯作者: Naoko Yoshizawa

Roles of G4 binding and multimization of Rif1 in S phase regulation in fission yeast cells.

G4 结合和 Rif1 多重化在裂殖酵母细胞 S 期调节中的作用。

• 发表时间: 2021
• 作者: Hisao Masai;Yutaka Kanoh;Kaho Takasawa;Daisuke Koida;Seiji Matsumoto
• 通讯作者: Seiji Matsumoto

Claspin, a key regulator of replication checkpoint, is differentially regulated in cancer and non-cancer cells.

Claspin 是复制检查点的关键调节因子，在癌细胞和非癌细胞中受到不同的调节。

• 发表时间: 2020
• 作者: Hiroyuki Sasanuma;Kousei Yamada;Ngo Trinh;Hisao Masai;Kosuke Yusa;Chi-Chun Yang and Hisao Masai
• 通讯作者: Chi-Chun Yang and Hisao Masai

Chromatin regulation that involves assembly of protein, lipid, and DNA with a special higher-order structure

染色质调控涉及蛋白质、脂质和具有特殊高阶结构的 DNA 的组装

• 发表时间: 2021
• 作者: Kohatsu;S.; Yamamoto;D;正井久雄
• 通讯作者: 正井久雄