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核内構造物への移動により制御される転写活性と蛋白質分解の共役的進行の可視化

转录活性和由进入核结构控制的蛋白质降解的耦合进程的可视化

基本信息

批准号：
17049004
负责人：
峯岸直子
金额：
$ 2.94万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

従来,蛋白質分解の研究は細胞の集団から蛋白質を抽出して免疫ブロット法等の解析を行うしか方法がなく,われわれも同様の方法により転写因子GATA2発現の細胞周期特異的な分解を見いだし報告した.しかし,このような解析には細胞周期を同調させた細胞集団が必要であり,多様な増殖特性を持つ細胞を持ち,細胞周期の同調が困難な正常組織の細胞を用いた解析は不可能であった.一方,免疫組織化学的方法においては,個々の細胞における発現を捉えられるものの,定量的解析が困難であった.そこで,我々は,転写因子等の核内因子と,細胞表面抗原,DNAの多重蛍光染色を行い,フローサイトメーターを用いて解析する方法を検討した.この方法では,性質の異なる細胞集団ごとにゲートをかけた解析が可能であり,また,個々の細胞の持つDNA量と転写因子発現の関係を2次元の図として解析することができる.我々は,造血幹細胞を含む細胞分画の解析を行い,GATA2発現はS期からG2期にかけて高く,M期に低下することを明らかにした.M期には細胞周期を進行させるサイクリン等の分解も起きるが,GATA2とサイクリンとDNAの3重染色の結果から,GATA2の分解はサイクリンBの分解より早い段階に起きることを見いだした.このような蛋白質分解制御はGATA2に特異的であり,類似のDNA結合特性を持つGATA1においては認められなかった.さらに,我々は緑色蛍光蛋白質とGATA2およびその変異体との融合蛋白質のフローサイトメーター解析を行い,サイクリン/Cdk複合体による複数のセリン/スレオニン残基のリン酸化がGATA2の細胞周期特異的分解を制御していることを明らかにした.

In recent years, the study of protein decomposition has been carried out by cell aggregation, protein extraction, immune analysis, etc. The same methods have been used to describe the cell cycle specific decomposition of GATA2. Cell cycle homology analysis is necessary for cell aggregation, diversity characteristics are maintained, cell cycle homology is difficult, and cell analysis is impossible for normal tissues. On the one hand, immunohistochemical methods are difficult to detect and quantify the presence of individual cells. The method of DNA analysis is discussed in this paper. This method is based on the analysis of the relationship between the amount of DNA held by a cell and the expression of a gene. In the analysis of hematopoietic stem cells, GATA2 expression is high in S phase and low in M phase. In M phase, cell cycle is broken down. GATA2 DNA is broken down in 3-fold staining. The protein breakdown mechanism is specific to GATA2, similar to DNA binding characteristics. In the meantime, we have analyzed the fusion protein of green fluorescent protein and GATA2, and found that the protein/Cdk complex contains a plurality of amino acid residues to control the cell cycle specific decomposition of GATA2.