生細胞内分子間相互作用の定量的解析技術の開発

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分子間相互作用によって制御される分解調節にどのような細胞内因子が関わっているかを明らかにすることは、蛍光プローブの定量性を検討する上で非常に重要である。そこで本年度はこの分解調節機構を同定することを目的とした解析に最も力を注いだ。昨年度までに同定した、分解制御性プローブに共通して結合している細胞内タンパク質をRNAi法により順番にノックダウンして、蛍光プローブの強度変化を解析した。もしも分解制御を担う因子であった場合には、そのノックダウンによりDsRedの分解が抑制されることにより、蛍光強度の増強が起こると予想される。そこで、DsRedの蛍光強度を指標に、ノックダウンによって蛍光増強を起こす因子を探索した。その際、やはり昨年度において予想したとおりいくつもの因子が細胞の生存に必須であったため、誘導発現系を用いて時間経過を追跡する方法を用いた。その結果、いくつかの「分解制御候補因子」を同定することに成功した。本研究においては、単なる分解御系の同定だけではなく、そのシステムが定量的な測定に与える影響を明らかにすることが本来の目的であるため、まずは同じ蛍光タンパク質のDsRedとKaedeが同じように分解制御を受けているのかどうかに関して、解析を進めた.その結果、分解制御因子と予想されているタンパク質をノックダウンした場合に、DsRedでは著しい蛍光増強が見られたのに対して、Kaedeではむし逆に蛍光が減弱することが明らかとなった.このことは変性タンパク質を判定し分解系に引き渡す細胞内制御システムはあまり単純なものではなく、蛍光タンパク質同士であっても別経路によって制御されている可能性を示したものである.