微小管ダイナミックス制御の構造的基礎

微管动力学控制的结构基础

• 批准号: 19037017
• 负责人: 箱嶋 敏雄
• 金额: $ 3.84万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19037017/
• 关键词: CLIP-170; チューブリン; EB1; APC; CLASP

本年度は, CLASPのEB1やチューブリンや微小管結合ドメインの試料調製を進めるとともに相互作用を解析した. 先ず, in vivoの機能解析が進んでいるCLASP2γを用いて, EB1との結合に関与するドメインの種々の発現コンストラクトを作成して, 大腸菌をホストとした高効率の調製系を確立した. 発現タンパク質のGSTタグを利用して, 簡便なpull-downアッセイでEB1と結合する領域を同定した. 更に, この最小の結合領域を用いて, EB1-CLASP2γ複合体を結晶化ロボット(既設のHYDRA-II)を用いて結晶化スクリーニングした. その結果, 複合体結晶を得られたので, セレノメチオニン誘導試料結晶も調製して, SPring-8での放射光実験によりx線強度データを収集した. MAD法とMRを組み合わせて位相決定して, 複合体構造を精密化した. その結果, EB1のα-らせんの束が形成する疎水性ポケットにCLASP2γのIPモチーフが結合していることが明らかとなった.さらに, IPモチーフの周辺の相互作用に重要な残基も同定した. 今後, 得られた構造に基づいた点変異実験を組み合わせた機能解析により, 特異性に重要な残基を決定するとともに, チューブリンや微小管、他の+TIPとCLASPとの間の相互作用の関係, 正または負に干渉する, あるいは全く干渉しない, を解析して機能との関係を考察した後に, 論文としてまとめる.

今年，我们开始准备clasp的EB1，微管蛋白和微管结合域的样品，并分析了它们的相互作用。首先，我们使用了正在进行体内功能分析的CLASP2γ来建立大肠杆菌托管的高效制备系统。使用表达蛋白质的GST标签，我们确定了在简单的下拉测定中结合EB1的区域。此外，使用该最小结合区域，使用结晶机器人（现有的hydra-ii）将EB1-CLASP2γ复合物结晶。结果，我们获得了一个复杂的晶体，还制备了硒甲米汀诱导的样品晶体，并通过Spring-8中的同步加速器辐射实验收集X射线强度数据。复杂的结构是通过将MAD和MR结合在一起来完善的。结果表明，clasp2γ的IP基序与EB1的α-螺旋束形成的疏水口袋结合。此外，还确定了对IP基序相互作用很重要的残基。将来，使用点突变实验的功能分析基于获得的结构来确定对特异性重要的残基，并在分析了微管蛋白，微管以及其他 +TIPS和扣之间的关系之后，阳性或负干扰，或根本没有干扰，以及功能之间的关系。

项目成果

CLIP-170による微小管認識機構

CLIP-170的微管识别机制

• 发表时间: 2007
• 作者: Katsumura;T.;Oda;S.;Mitani;H.;Kawamura;S.;Oota;H.;A.Terakita;三島正規
• 通讯作者: 三島正規

RacGEF Tiam1/2の新規なタンパク質標的認識ドメインの構造

RacGEF Tiam1/2 新型蛋白质靶标识别结构域的结构

• 发表时间: 2008
• 作者: Machida;R.J.;Y.Hashiguchi;M.Nishida;S.Nishida.;河村正二;村上 聡;箱嶋敏雄
• 通讯作者: 箱嶋敏雄

CLIP-170による微小管認識の構造的基礎

CLIP-170识别微管的结构基础

• 发表时间: 2007
• 作者: 樋渡智秀、白井祐介、三上章允、後藤俊二、Suryobroto;B.、Perwitasari-Farajallah;D.、Malaivijitnond;S.、Siriaroonrat;B.、太田博樹、河村正二;高野 浩輔;吉森保;箱嶋敏雄
• 通讯作者: 箱嶋敏雄

植物核内受容体の作用機構

植物核受体的作用机制

• 发表时间: 2009
• 作者: 村瀬浩司;平野良憲;Tai-ping Sun;箱嶋敏雄
• 通讯作者: 箱嶋敏雄

微小管制御因子EB1の構造解析

微管调节因子EB1的结构分析

• 发表时间: 2008
• 作者: Sumiya;H.;K.Wakabayashi;金場哲平
• 通讯作者: 金場哲平