核膜サブドメインを形成する分子基盤と形成機構の解析

核膜亚结构域分子基础及形成机制分析

基本信息

批准号：
19038027
负责人：
今本尚子
金额：
$ 5.31万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物が進化の過程で獲得した核膜は、遺伝子を封入して遺伝子機能を担う因子群を濃縮するだけでなく、高次クロマチン構築の足場として遺伝子機能を支える細胞内構造である。核膜とクロマチンの物理的・機能的繋がりを探るため、核膜に存在する最も顕著な構造体である核膜孔複合体に注目し、その挙動を調べた。その結果、核膜孔複合体の分布が細胞分裂終期に核膜が形成されるときに定まること、また、その分布がG1初期の細胞運命が決定される時期に崩れること、更に、核膜孔複合体の分布にlaminなどの核内膜因子が積極的に寄与することを明らかにしてきた。細胞機能に即して規則的に変化する核膜上のこの領域を核膜サブドメインと名付けた。膜貫通型の核膜孔複合体因子や異なるサブドメインに局在する核内膜因子の各々に、異なる蛍光タンパク質を付加して同時に2種タンパク質を安定に発現する細胞株を取得し、ライブ観察を行った。その結果、核膜形成初期に核内膜や核膜孔複合体などの因子群が染色体側部にまず集積し、その後、染色体上を局在化することでサブドメインが形成されることを確認した。この過程を生化学的に解析するため、取得した安定発現株の、分裂期のセミインタクト細胞を作成した。そのセミインタクト細胞に細胞抽出液とATPを添加すると、添加した因子に依存して、膜貫通型の核膜因子が染色体側部にターゲットし、更に、染色体上を局在化することがわかった。生細胞で見られる核膜形成初期反応を、in vitroで再構築できたことを示す結果である。蛍光チューブリンを加えると、この再構成では、紡錘体形成も再現され、核膜因子の局在化に関与することを示唆する結果を得ている。この系を利用することにより、核膜形成を担う可溶性因子や核膜因子の局在化機構、並びに、核膜因子を集積させる染色体側要素の、生化学的解析が可能になる。当初の研究目的を十分に達成したと考える。

真核生物进化过程中获得的核膜是一种细胞内结构，不仅封装了基因以丰富负责基因功能的因子组，而且还支持基因功能作为构造高阶染色质的脚手架。为了探索核膜和染色质之间的物理和功能连接，我们专注于核孔复合物，核孔复合物是核膜中最突出的结构，并研究了其行为。结果，已经揭示了核孔复合物的分布是在细胞分裂结束时形成核膜时的分布，其分布在确定早期G1中的细胞命运时崩溃，并且子宫内膜因子（例如lamin）积极地有助于核孔复合物的分布。根据细胞功能定期变化的核膜上的该区域被命名为核膜亚域。通过向每个跨膜核孔复合因子添加不同的荧光蛋白和固定在不同子域的内载因子并进行了实时观察，从而获得了稳定表达两种蛋白的细胞系。结果，已经证实，在核膜形成的早期阶段，诸如胚胎和核孔复合物等因素首先积聚在染色体侧，然后在染色体上定位以形成子域。为了分析这一过程，我们创建了获得稳定表达菌株的有丝分裂半完整细胞。已经发现，当将细胞提取物和ATP添加到半完整细胞中时，跨膜核膜因子靶向染色体侧并定位在染色体上，具体取决于附加因子。该结果表明，在活细胞中看到的对核膜形成的最初反应可以在体外重建。添加荧光微管蛋白还可以在此重建中复制主轴形成，结果表明它参与了核膜因子的定位。通过使用该系统，对负责形成核膜形成的可溶因子和核膜因子的定位机制的生化分析以及积累核膜因子的染色体元素。我们认为，最初的研究目标已经完全实现。