細胞増殖におけるプロテインキナーゼCの機能の分子生物学的研究

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昨年度までに得た種々のPKC及びPKC関連cDNA、及び各々にコードされた蛋白を認識する特異抗体等を用いて種々の実験を行ない以下の結果を得た。(1) 4種のPKCcDNAをCOS細胞で発現させる系を確立した。この系を用いて、α、βI、βII、γのすべてのPKC分子種が高親和性のホルボールエステル受容体活性を持つことを明らかにした。(2) 上記4種のPKCとは異なった関連蛋白nPKCεについて、特異抗体の作成、COS細胞によるcDNAの発現系の確立、nPKCε分子と他の4種のPKC分子種との分離系の確立等を行なった。そしてそれらを用いる事によりi)nPKCε分子は脳を含むいくつかの組織、細胞株で蛋白質レベルで発現している事。ii)nPKCεは4種のPKCとは異なった性質をもつ従来知られていなかったタイプのプロテインキナーゼ活性をもつ事。iii)nPKCεは4種のPKCとは異なった新しいタイプのホルボールエステル受容体である事。等を示した。(3) PKCα及びcDNAレベルで作成したいくつかの人工変異体について各cDNAをデキサメタゾンで誘導可能なMMTVプロモーター支配下に発現させる様設計した発現ベクターを構築した。これらのラット3Y1細胞に導入し安定な細胞株を多数得、その中からデキサメタゾンによりPKC蛋白が誘導的に発現する細胞株を撰別した。この様にして得た細胞株のセットを用いて種々の実験を行ないその結果以下の結論を得た。i)アクチンのストレスファイバーの消失を伴なう細胞の形態変化、ii)細胞増殖、iii)c-tos,collagenase等の遺伝子の転写誘導等、従来ホルボールエステルによって引き起こされる事が知られていた細胞応答現象にPKCα分子のキナーゼ活性が必須である事が示された。