枯草菌における有用遺伝子の新発現制御系の開発

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我々はBacillus licheniformis ATCC9945a株由来の野生型(誘導性)および構成性ペニシリナーゼ生産株をDNA供与体として、ペニシリナーゼ構造遺伝子(penP)、リプレッサー遺伝子(penI)および酵素誘導に必須の正の制御遺伝子(penJ)をBacillus subtilisおよびB.licheniformisを宿主としてクローニングし、これらを元に種々のpenP分泌ベクターを構築してきた。これらの遺伝子について、塩基配列決定と蛋白の解析により、リプレッサー蛋白(penI、分子量14,983)は128アミノ酸から、penJ蛋白(分子量63,388)は601アミノ酸から成っていることが示された。プロモーターの下流には、典型的なオペレーター配列が存在していた。塩基配列決定の結果、penPとpenI-penJは逆向きの別オペロンを形成していることが明らかになった。更に、penPプロモーターの内部と下流に連続したオペレーター配列が認められたことから、リプレッサーによる厳密な形質発現の抑制が予想された。我々はリプレッサーを精製したのち、オペレーターとの結合をゲルシフトアッセイにより確認した。さらに部位特異的変異処理によち、オペレーターの2回転対称性を失わせたところ、リプレッサー蛋白の生産量が増大すると共にペニシリナーゼ発現がより強く抑制されていることが認められた。さらに部位特異的変異により数種の温度感受性リプレッサーを作成し、ペニシリナーゼ発現制御系への利用を検討した。特にPro70→Leu70の変異リプレッサーは温度感受性が高く、30℃と48℃での酵素誘導比は約44倍にも達した。また、セファロスポリンCによる最大誘導には2〜3時間を要するが、温度シフトによる誘導では1時間以内であり、その即応性が明らかになった。