NMRを用いた紫外線損傷DNA修復機構の構造生物学的解析

使用 NMR 对紫外线损伤 DNA 修复机制进行结构生物学分析

• 批准号: 15023216
• 负责人: 嶋田 一夫
• 金额: $ 3.07万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15023216/
• 关键词: HIV; ケモカイン; NMR; 構造生物学; 相互作用

当研究室は、安定同位体標識DNA光産物の調製に成功し、多次元NMR法によるNMRシグナル帰属が完了している。本年度は、高度好熱菌由来のCPD-photolyase(阪大・院理・倉光博士より大腸菌発現系が供与された)を題材として、紫外線損傷DNA(CPD)と修復酵素の相互作用を原子レベルで明らかにすることを行った。CPD-photolyaseの精製法については、従来法に改善を加え、より安定な蛋白質を得ることができた。我々は、CPD-photolyaseの第一補酵素であるFADを長時間安定にラジカル型に保持することに成功し、安定同位体標識したラジカル型CPD-photolyase-CPD複合体において2次元NMRを測定した。その結果、FADの不対電子に起因する距離依存的なシグナルの広幅化がCPD由来シグナルにおいて観測された。これによりFAD-CPD間距離の見積もり精度が大幅に向上し、従来提唱されていた複合体モデルや修復反応機構に重要な裏付けを与えた。天然物ラジカルを利用したこのような手法は世界的に類を見ない。さらに、アミノ酸特異的に安定同位体標識したCPD-photolyaseのシグナルの広幅化を観測し、立体構造座標と合わせて、ラジカルによるシグナルの広幅化と距離の関係をより正確に決定することを試みている。また、修復酵素による損傷DNAの効率的な認識機構を解析するには、損傷DNAを必要な鎖長の2本鎖DNAに組み込む必要がある。しかし、効率の良い大量調製法は確立されていない。そこで、T4-DNAリガーゼを用いて短鎖DNAをつなぎ合わせる手法によって目的物を得る方法を開発に着手した。

When the laboratory successfully modulated DNA photoproducts with stable isotopes, the NMR spectrum was completed. This year, CPD-photolyase, the origin of highly pathogenic bacteria, is the subject of ultraviolet-damaged DNA(CPD) and the interaction of repair enzymes. CPD-photolyase purification method is used to improve protein stability. The first complement enzyme of CPD-photolyase, FAD, was successfully identified by 2D NMR. As a result, FAD does not depend on the distance of the electron source. The accuracy of the distance between FAD and CPD is greatly improved, and the repair of the complex is important. Natural materials are used in the world. In this paper, we use acid-specific stable isotope identification, CPD-photolyase amplification and measurement, stereo structure coordinates and combination, and try to correctly determine the relationship between amplification and distance. The repair enzyme is responsible for the analysis of the mechanism of DNA damage, and the DNA repair enzyme is responsible for the analysis of DNA damage. A large number of modulation methods with good efficiency have been established. T4-DNA is the first to be used in the development of a method for obtaining target DNA.

项目成果

Hiroto Kawashima: "^1H, ^<13>C, and ^<15>N backbone resonance assignments of the hyaluronan-binding domain of CD44"J.Biomol.NMR. In Press. (2003)

Hiroto Kawashima：“CD44的乙酰透明质酸结合结构域的^ 1 H、^ 13 C和^ 15 N主链共振分配”J.Biomol.NMR。

Yoshimasa Kyogoku: "Structural Genomics of Membrane Proteins"Accounts.Chem.Res. 36. 199-206 (2003)

Yoshimasa Kyogoku：“膜蛋白的结构基因组学”Accounts.Chem.Res。

Lee CW: "Molecular basis of the high-affinity activation of type 1 ryanodine receptors by imperatoxin A."Biochem J.. 377. 385-394 (2003)

Lee CW：“欧前胡毒素 A 高亲和力激活 1 型兰尼定受体的分子基础。”Biochem J.. 377. 385-394 (2003)

Noritaka Nishida: "Novel Collagen-Binding Mode of the VWA Domain Determined by a Transferred Cross-Saturation Experiment"Nature Struct.Biol.. 10. 53-58 (2003)

Noritaka Nishida：“通过转移交叉饱和实验确定的 VWA 结构域的新型胶原蛋白结合模式”Nature Struct.Biol.. 10. 53-58 (2003)

Koh Takeuchi: "Structural basis of the KcsA K^+ channel and agitoxin2 pore-blocking toxin interaction by using the transferred cross-saturation method"Structure. 11. 1381-1392 (2003)

Koh Takeuchi：“使用转移交叉饱和法的 KcsA K^ 通道和 agitoxin2 孔阻塞毒素相互作用的结构基础”结构。