NMRを用いた紫外線損傷DNAの構造生物学的解析

点击翻译按钮获取中文摘要

T. Thermophilus HB27由来CPD photol yaseを大腸菌により大量発現させた。Polyethyleneimine、P11 column、DNA-cellurose column、DEAE Sephadex A-25 columnによってSDS-PAGEで単一のバンドとして観測されるまで精製した。得られたphotolyaseとCPDを含む一本鎖DNAヘプタマー(ss7mer CPD)を混合し、370nmの光を照射することにより、CPDが修復ざれることを確認した。バッファー中の還元剤(sodium ditionite、Na2S204)め量を調節することにより、photolyaseの酸化還元状態を還元型およびラジカル型に統一した。基質DNAとしては、紫外線照射によりCPDを生じたDNAオリゴマーを、逆相HPLCで精製して用いた。以上のphotlyaseと損傷DNAをNMR解析に供した。まず、photolyaseの補酵素FADの酸化還元状態の変化に伴う、ポリペプチド鎖およびFADに由来するシグナルの強度変化を調べた。FADに関しては、他のシグナルと分離して観測することが可能であるリン原子を観測対象とした。還元型およびラジカル型CPD photolyaseの31P NMRスペクトルを測定した結果、ラジカル型ではFADの2個のリン酸に由来するシグナルのうち1つが消失した。一方、ポリペプチド鎖に関しては光反応の際に電子伝達の経路となる可能性が示峻されているトリプトファン残基を観測対象とした。ラジカル型ではTrP24β、Trp352を含む3残基に由来するシグナルが消失した。したがって、FADラジカルの影響によりFAD近傍にある原子を同定することが可能となった。