NMRを用いた紫外線損傷DNAの構造生物学的解析

使用 NMR 对紫外线损伤的 DNA 进行结构生物学分析

• 批准号: 13214024
• 负责人: 嶋田 一夫
• 金额: $ 2.82万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13214024/
• 关键词: 核磁気共鳴法; 損傷DNA; 構造生物学; FAD; CPD photolyase

T. Thermophilus HB27由来CPD photol yaseを大腸菌により大量発現させた。Polyethyleneimine、P11 column、DNA-cellurose column、DEAE Sephadex A-25 columnによってSDS-PAGEで単一のバンドとして観測されるまで精製した。得られたphotolyaseとCPDを含む一本鎖DNAヘプタマー(ss7mer CPD)を混合し、370nmの光を照射することにより、CPDが修復ざれることを確認した。バッファー中の還元剤(sodium ditionite、Na2S204)め量を調節することにより、photolyaseの酸化還元状態を還元型およびラジカル型に統一した。基質DNAとしては、紫外線照射によりCPDを生じたDNAオリゴマーを、逆相HPLCで精製して用いた。以上のphotlyaseと損傷DNAをNMR解析に供した。まず、photolyaseの補酵素FADの酸化還元状態の変化に伴う、ポリペプチド鎖およびFADに由来するシグナルの強度変化を調べた。FADに関しては、他のシグナルと分離して観測することが可能であるリン原子を観測対象とした。還元型およびラジカル型CPD photolyaseの31P NMRスペクトルを測定した結果、ラジカル型ではFADの2個のリン酸に由来するシグナルのうち1つが消失した。一方、ポリペプチド鎖に関しては光反応の際に電子伝達の経路となる可能性が示峻されているトリプトファン残基を観測対象とした。ラジカル型ではTrP24β、Trp352を含む3残基に由来するシグナルが消失した。したがって、FADラジカルの影響によりFAD近傍にある原子を同定することが可能となった。

T. Thermophilus HB27 from CPD photolyase を escherichia coli によ を abundant occurrence させた. Polyethyleneimine, P11 column, DNA-cellurose column, DEAE Sephadex A-25 columnによってSDS-PAGEで単 <s:1> バ ドと て観 て観 test されるまで refined た. Have ら れ た photolyase と CPD を containing む a lock DNA ヘ プ タ マ ー ss7mer (CPD) を mixed し, 370 nm の を sunlight す る こ と に よ り, CPD が repair ざ れ る こ と を confirm し た. バ ッ フ ァ ー の also yuan tonic (sodium ditionite, Na2S204) を め quantity adjustment す る こ と に よ り, photolyase の acidification type also yuan state を yuan お よ び ラ ジ カ ル type に unified し た. Substrate DNA と し て は, ultraviolet irradiation に よ り CPD を raw じ た DNA オ リ ゴ マ ー を, reverse phase HPLC で refined し て in い た. The above <s:1> photlyaseと damage DNAをNMR analysis に is provided for た た. ま ず, photolyase の repair enzyme FAD の acidification is の yuan state - に with う, ポ リ ペ プ チ ド lock お よ び FAD に origin す る シ グ ナ ル の intensity variations change を adjustable べ た. FAD に masato し て は, he の シ グ ナ ル と separation し て 観 measuring す る こ と が may で あ る リ ン atomic を 観 measure like と seaborne し た. Also type yuan お よ び ラ ジ カ ル type CPD photolyase の 31 p NMR ス ペ ク ト ル を determination し た results, ラ ジ カ ル type で は FAD の 2 の リ ン acid に origin す る シ グ ナ ル の う ち 1 つ が disappear し た. Party, ポ リ ペ プ チ ド lock に masato し て は light anti 応 の interstate に electronic 伝 da の 経 road と な が る possibility that opened in さ れ て い る ト リ プ ト フ ァ ン residues を 観 measure like と seaborne し た. Youdaoplaceholder0 ラジカ type で で TrP24β, Trp352を containing む3 residues に origin するシグナ が が disappearance た た The influence of たがって たがって and FADラジカ ラジカ たがって is によ によ. FAD is adjacent to にある atoms を. Youdaoplaceholder5 する とが may となった.

项目成果

Kazuyasu Shindo: "Solution Structure of Micelle-bound H5 Peptide (427-452) : A Primary Structure Corresponding to the Pore-Forming Region of the Voltage Dependent"Biochem. Biophys. Acta.. 1545. 153-159 (2001)

Kazuyasu Shindo：“胶束结合的 H5 肽 (427-452) 的溶液结构：对应于电压依赖性成孔区域的一级结构”Biochem。

Tamiji Nakanishi.: "Determination of the Interface of a Large Protein Complex by Transferred Cross-saturation Measurements"J. Mol. Biol.. (in press). (2002)

Tamiji Nakanishi.：“通过转移交叉饱和度测量确定大蛋白质复合物的界面”J。

Tomohisa Aoyama: "Identification and characterization of an antibacterial peptide in The 26-Kda protease of Sarcophaga peregrina having antibacterial activity"J. Biochem.. 130. 313-318 (2001)

Tomohisa Aoyama：“具有抗菌活性的游隼 26-Kda 蛋白酶中抗菌肽的鉴定和表征”J.