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レポーター発現を指標とした幹細胞の単離と細胞特性の解析

以报告基因表达为指标，分离干细胞并分析细胞特征

基本信息

批准号：
08878138
负责人：
阿部訓也
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

始原生殖細胞(PGC)、神経冠細胞ともに幹細胞的性質を有し、多文化能を保持しつつ胚体内を移動し、行き着いた先の微少環境に応じて、PGCは生殖細胞に、神経冠細胞は神経組織、間葉系、内分泌組織などに分化する。これらの細胞の多文化能の維持、或いは各種の細胞への分化の機構は、未だ遺伝子レベルでは明らかではない。これはこの種の幹細胞は胚発生時に少数しか存在せず、単離も困難なため、直接そこに発現する遺伝子群を解析する段階まで至っていないことに起因すると思われる.そこで何らかの方法でこれらの細胞をマークし、単離した後、様々な角度から解析を行うことが重要と考えられる。そこで本研究では、まずマウスPGCを純化・単離する技術を確立することを目標とし実験を行った。具体的にはPGCのマーカーであるアルカリフォスファターゼ遺伝子をlacZ(大腸菌β-ガラクトシダーゼ)遺伝子で置換したTNAP(組織非特異型アルカリフォスファターゼ)ノックアウトマウスを用い、lacZ発現を指標としてPGCを分離、純化する方法を開発した.すなわち、PGCを含む胚体組織を解離し、細胞懸濁液を得、これにβ-ガラクトシダーゼの蛍光基質であるFDGを細胞内を取り込ませ、セルソーターを用いてlacZ陽性細胞を検出、単離するというものである.lacZ陽性を示す細胞がPGCであることを確かめるため、単離した蛍光陽性の細胞に対していくつかのPGCマーカーによる染色を行った。まずアルカリフォスファターゼ染色をのすると蛍光陽性細胞の95^〜98%が染色されることが判明した。染色される細胞は、典型的な始原生殖細胞の形態を持つことが確かめられた。また、PGCの増殖に必須なチロシンキナーゼであるc-Kitの抗体で染めたところ、やはり^〜98%の細胞が染色された。これらの結果より、今回用いた手法により、PGCを従来の方法では得ることできなかった非常に高い純度で単離することができることが明らかになった。また、神経冠細胞においてレポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを樹立し、このマウスでは移動期以降の神経冠細胞、或いはそれに由来する組織を特異的にマークすることができることを示した.この系統を利用し、神経冠細胞の細胞系譜解析や上記の技術を利用しての神経冠細胞の単離実験を行っている.

The characteristics of primordial germ cells (PGC), neuronal corona cells and stem cells are different, multiculturalism can be maintained, embryo movement can be maintained in vivo, and there is little environment for migration. PGC is a germ cell, and neuronal corona cells are differentiated into nervous tissue, mesenchymal system and endocrine tissue. The multicultural ability of these cells can be maintained, or the differentiation of various cells can be achieved. The stem cells of this kind are rare, difficult to isolate, and difficult to generate directly. The method of analysis is very important. This study was conducted in the presence of PGC. Specifically, a method for PGC isolation and purification of lacZ(E. coli β-glucuronidase) was developed by using TNAP(tissue-independent glucuronidase) as an indicator of lacZ development. PGC contains embryonal tissue dissociation, cell suspension acquisition, beta-and beta 95%~ 98% of the cells stained were positive. Staining cells are typical of primordial germ cells. PGC must be cultured with c-Kit antibodies, and 98% of cells are stained. The result of this is that the method of PGC is very high purity. The cells in the brain are not normal. This system is used to analyze the cell line spectrum of the cerebral corona cells, and the techniques described above are used to analyze the isolation of the cerebral corona cells.