哺乳類・初期生殖細胞における遺伝子発現の研究

哺乳动物早期生殖细胞基因表达研究

• 批准号: 07283219
• 负责人: 阿部 訓也
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kumamoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07283219/
• 关键词: 始原生殖細胞; マウス; cDNA; 生殖系列; 全能性

始原生殖細胞(PGC)は生殖系列の最も初期に出現する細胞であり、マウスでは原腸胚形成時に初期未分化細胞である胚体外胚葉から分化してくるとされている。したがって、PGCにおける遺伝子発現プロファイルを詳細に比較検討することにより、生殖細胞分化過程および体細胞-生殖系列の分岐に関しての分子レベルでの知見が得られることが期待される。しかし、PGCというごく少数の細胞を単離し、直接そこに発現する多数の遺伝子を解析するのは通常の手法では大変困難であった。そこで今年度は初期のステージよりマウスPGCを単離する技術を確立することを第一義的な目標とし実験を行ってきた。具体的にはPGCのマーカーであるアルカリフォスファターゼ遺伝子をlacZ(大腸菌β-ガラクトシダーゼ)遺伝子で置換したTNAP(組織非特異型アルカリフォスファターゼ)ノックアウトマウス(TNAPKO)を用い、lacZ発現を指標としてPGCを分離、純化する方法を開発した.方法としては、PGCを含む胚体組織をTNAPマウスから取りだし、トリプシン処理、ピペッティングにより解離し、浸透圧ショックによりb-ガラクトシダーゼの基質であるFDGを細胞内に取り込ませた。FDGがb-galと反応すると蛍光を発することを利用し、セルソーターを用いてlacZ陽性細胞を検出、単離し、陽性細胞の性質を検討した。実際にソーティングにより蛍光陽性の細胞を単離し、アルカリフォスファターゼ染色をすると蛍光陽性細胞の95^〜98%が染色させることが判明した。染色される細胞は、比較的大きく丸い形状のもので、核が著しく大きい、という典型的な始原生殖細胞の形態を持つことが確かめられた。また、PGCの増殖に必須なチロシンキナーゼであるc-kitの抗体で染めたところ、やはり^〜98%の細胞が染色された。これらの結果より、レポーター発現を指標としたフローサイトメトリー法により、従来の方法では得ることができなかった、非常に高い純度の幹細胞を単離し得ることが明らかになった。現在はさらに初期のPGC単離のための条件検討を行うとともに、12.5日胚、13.5日胚由来のPGCを単離、プールしており、これを用いたcDNAライブラリー作製の準備を行っている。

The primordial germ cell (PGC) is the cell that appears at the beginning of the reproductive series and the undifferentiated cell at the beginning of gastrulation. PGC gene development process is discussed in detail. The genetic differentiation process and molecular differentiation process related to the differentiation of somatic cell-reproductive series are expected to be discussed in detail. PGC analysis is difficult for a small number of cells to be isolated and directly detected, and for a large number of cells to be analyzed. This year's first phase of PGC technology was established. Specifically, a method for PGC isolation and purification was developed for PGC detection and identification of lacZ(E. coli beta-) gene replacement by TNAP(tissue-independent) gene. Methods: PGC containing TNAP cells were extracted from TNAP cells, and FDG cells were extracted from TNAP cells. FDG has been used to detect, isolate and characterize positive cells. 95 - 98% of the light-positive cells were identified by staining. Staining of cells, comparison of the shape of the large pill, nuclear, large, medium typical of the original germ cell morphology, maintain the correct PGC must be cultured with c-kit antibodies and 98% of cells stained. The results of this study are as follows: Now, the conditions for PGC separation in the early stage are discussed. The preparation for PGC separation, separation, and cDNA separation in the early stage is carried out on the 12.5-day and 13.5-day embryos.

项目成果

Nagata,T.et al.: "Physical mapping of the retinoid X receptor β in mouse and man." Immunogenetics. 41. 83-90 (1995)

Nagata, T. 等人：“小鼠和人类中视黄醇 X 受体 β 的物理图谱。” 41. 83-90 (1995)。