マウス始原生殖細胞における遺伝子発現の解析

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我々は生殖系列分岐の鍵となる始原生殖細胞(PGC)に着目し,この細胞に発現する遺伝子の体系だった解析を行うことを目的とし研究を開始した.PGCは初期胚にごく少数、それも体細胞にかこまれたかたちで存在するため、研究材科として直接取り扱うことが困難であった.そこで、PGCのマーカーであるアルカリフォスファターゼ遺伝子をlacZ遺伝子で置換したTNAP(組織非特異型アルカリフォスファターゼ)ノックアウトマウスを用い、lacZレポーター発現を指標としてPGCを分離、純化するFACS-gal法を確立した.10.5日-14.5日胚がらPGCを実際にソーティングし、各種マーカーを用いた検索によりほぼ100%に近い純度のPGCが得られたことを確かめた.さらに,より初期のPGC単離のために,Oct3/4プロモーターにGFPをつないだコンストラクトを用いて,トランスジェニックマウスを作製し,これらのトランスジェニック系統の胚体から,より効率良くPGCを単離してくることが可能になった.この純化PGCを用い、テロメレース活性測定やゲノムDNAメチル化様式などの解析が可能になった.また,これを材料に、ローンリンカー法(Mamma1ian Genome2;252-259、1992)によりcDNAライブラリー作製を行った.この純化PGCからのcDNAは既知遺伝子のPGCでの発現解析のみならず、PGCにおける遺伝子発現プロファイルを解析、記述するために有用である.その解析の一端としてこれまで13.5日胚の雌難のPGCそれぞれのライブラリーから4000クローンをピックアップし、2800クローンの配列決定を行なった.このうち有効な配列情報の得られた1555クローンに関してホモロジー検索を行った.その多くはESTクローンを含め既知の遺伝子と相同性を示した.また雌雄で出現頻度に差異のあるクローンも複数認められた.将来的には,PGC各発生段階からライブラリーを作製,解析することにより興味深い配列モチーフを持つクローンやステージ特異的発現を示すクローンを単離し,機能解析につなげていきたいと考えている.また,始原生殖細胞の属性を遺伝子発現レベルで理解していくために,cDNA microarrayを用いた網羅的発現解析を計画している.