Reversible O-Phosphorylierung von Hydroxyprolin und Hydroxylysin in Proteinen

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Der vorliegende Antrag hat das Ziel, bisher wenig untersuchte O-Phosphorylierungen an Hydroxy-L-prolin- und Hydroxy-L-lysinResten in Proteinen zu identifizieren sowie deren biochemische Bedeutung zu entschlüsseln. Dazu müssen zunächst grundlegende Methoden, insbesondere eine sensitive Analytik, entwickelt werden. Aufbauend auf unseren Vorarbeiten sollen die nötigen Aminosäurederivate synthetisiert und die Synthese der Phosphopeptide etabliert werden. Diese Phosphopeptide stellen dann die Grundlage für die Entwicklung einer umfassenden Proteinanalytik mittels Chromatographie, Gelelektrophorese, Aminosäureanalytik, Edman-Abbau, Massenspektrometrie und spezifischer Antikörper dar. Die sehr sensitive Massenspektrometrie verspricht die zentrale Methode zur Identifizierung phosphorylierter Hyp- und Hyl-Rese in Proteinen zu werden. Sobald in einem Protein ein Phospho-Hyp oder eine Phospho-Hyl identifiziert wird, kann mittels Sequenzanalyse die genaue Position bestimmt werden. An diesem Protein wird dann der Einfluß der Phosphorylierung auf die Struktur und die Funktion des Proteins untersucht. Ferner soll die beteiligte Kinase identifiziert werden. Besitzen die produzierten Antikörper eine ausreichend hohe Spezifität und Sensitivität, soll das Phosphorylierungsmuster des ausgewählten Proteins in verschiedenen Geweben und Organen untersucht werden.