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ヒト Tissue Factor アポタンパク質の構造と機能に関する研究

人组织因子脱辅基蛋白的结构与功能研究

基本信息

批准号：
61580142
负责人：
中村伸
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1986
资助国家：
日本
起止时间：
1986 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-61580142/
关键词：
血液凝固開始因子 Tissue Factor TF-アポタンパク TFの構造・機能

项目摘要

本年度はTissue Factorアポタンパク質(TF-Apo)の精製法、およびその構造-機能相関について以下の成果を得た。1.TF-Apoの精製ならびに分子性状。ヒトリンパ腫由来のTF産生株(RET-1)を大量培養し、そのセルペレットをトリトン処理してTF-Apoを可溶化後、コンカナバリンA-カラム、DEAE-5PW-カラム及び第【VII】因子-カラムを活用した精製法を確立した。本精製法で、1×【10^(10)】個の細胞から9.400倍の精製度のTF標品を20Mg得た。TF-Apoは、N-グリコシルオリゴサッカライドを持つ糖タンパク質であるが、非常に強い疎水性を示し、界面活性化剤不在下では全く可溶化されなかった。TF-Apoの分子量は、トリトン共存下でのゲルろ過法で120KDaと推定され、一方、SDS-PAGE法では47KDaと推定された。また、pH4以下の酸性条件やイソプロパノール(18%以上)、アセトニトリル(8%以上)の有機溶媒に対しては不安定で、その活性を完全に失った。2.TF-Apo糖鎖の役割。マクロファージあるいは上述のRET-1細胞株を利用して糖鎖部分の欠損したTF-Apoの生合成素を確立した。糖鎖を欠いたTF-Apoは不安定で、特にプロテアーゼによる失活化を非常に受け易い。更に、リン脂質との再構成の時、正常のTF-Apoに比べ糖鎖を欠いたもののTF活性は著しく低下した。これらは、糖鎖部分がTF-Apoの構造安定性、ならびにリン脂質ミセルへの配向性等に、重要な役割を果たしていることを示唆している。なお、TF-Apoのアミノ酸組成や一次構造の解析、あるいは第【VII】因子との反応機序の検討に関しては、今後RET-1の大量培養を重ね、数百Mgレベルの精製標品を得て着手する。

This year, the following results were obtained through the refining method of Tissue Factor (TF-Apo) and the structure-function correlation. 1. Molecular properties of TF-Apo's refined products. The TF-producing strain (RET-1) derived from ヒトリンパを is cultured in large quantities, and the そのセルペレットをトリトン treatment is soluble in TF-Apo Later, the purification method using the Koruna purification method was established. According to this purification method, 1 × [10^(10)] cells can produce a 9.400 times purified TF standard product with 20Mg. TF-Apoは、N-グリコシルオリゴサッカライドをholding sugarタンパクqualityであるが、It is very strong and water-based. It is fully soluble because the interface activator is not included. The molecular weight of TF-Apo is 120KDa and the estimated molecular weight of TF-Apo is 120KDa and the SDS-PAGE method is 47KDa and the estimated molecular weight is 47KDa.また, やイソプロパノール (more than 18%), アセトニト under acidic conditions below pH 4 The organic solvent of リル (more than 8%) is not stable and active, and its activity is completely lost. 2.TF-Apo sugar lock is cut. The above-mentioned RET-1 cell line has been established using the MACHNOLOGY cell line, which lacks the ability to produce TF-Apo-derived synthetic hormones due to the lack of the sugar lock part. The sugar-locked TF-Apo is unstable and the special TF-Apo is inactive. When it comes to the reconstruction of lipids, normal TF-Apo is less active than sugar-locked TF, and the activity of TF is lower.これらは、sugar lock partがTF-Apoのstructural stability、ならびにリンlipidミThe alignment properties of セルへの, etc., are important. Analysis of the primary structure of NaNa, TF-Apo のアミノ acid composition, あるいは[VII] factor and reaction mechanism sequence In the future, RET-1 will be mass-cultivated and refined, and hundreds of Mg-refined standard products will be developed.