蛋白質プライミングDNAポリメラ-ゼの機能ドメイン

蛋白质引发 DNA 聚合酶的功能域

• 批准号: 01540534
• 负责人: 松本 幸次
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Sophia University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01540534/
• 关键词: DNAポリメラ-ゼ; 機能ドメイン解析; 蛋白質プライミング; in vitro突然変異導入; M2ファ-ジ

欠失突然変異導入による機能ドメイン解析:M2DNAをBal31で部分消化して得たDNA断片をtacプロモ-タ下流に挿入した組換えDNAクロ-ンを作成。これらのクロ-ンはIPTG誘導によりC末端に欠失をもつDNAポリメラ-ゼ(Pol)とプライマ-蛋白質(PP)を生産する。PPとPolは複合体を形成し、ホスホセルロ-スクロマトでcopurifyされるが、C末端を欠失するPolは、Pol単独と同様に溶出され、copurifyされない。これによりPolのC末端側(20〜100アミノ酸)にPPを結合する領域が存在することが示唆された。C末端側80アミノ酸程度の欠失ではPol活性を少々残こすものもあるが、蛋白質プライミング活性は全く失なわれており、蛋白質プライミング機能には、C末端側にあるPP結合領域が必須であることが判明した。Pol中央部については制限酵素切断部位を利用して付加・欠失突然変異Polを作成、PP結合能について現在検討中である。DNAポリメラ-ゼ高生産クロ-ンの作出:Pol遺伝子はtacプロモ-タ-等の高発現プロモ-タ-の下流に挿入する際はPP遺伝子とともにクロ-ニングすれば高発現を維持できる。これはPPがPolと複合体を形成し、Pol活性を不活性化することでクロ-ンを安定化しているためで、C末端を欠失するPolは複合体を形成できず、クロ-ンは不安定となりPolの生産量は減少した。より安定な高発現を得るため、非誘導時のリ-ク発現が最も少ないTタプロモ-タ-系を採用、安定なクロ-ンを確立した。又、不必要なDNA部分を削除することにより著しい発現量の改善を得られることを見出した。これにより、変異導入により改変・作出されたPolの精製を容易とし、Pol内にあるPol活性、蛋白質プライミング活性、複合体形成能等を定量的に評価するための有効な道を拓いた。

Analysis of function: Partial digestion of M2DNA, Bal31, DNA fragment, tac, downstream, insertion of DNA fragment. IPTG induces the C-terminal deletion of DNA and protein (PP). PP Pol complex formation, copurify, C-terminal loss, Pol only dissolution, copurify The C-terminal side (20 ~ 100 μ mol/L) of the Pol is present in the PP binding domain. C-terminal side 80-acid level deficiency, Pol activity, protein activity, protein function, C-terminal side PP binding domain deficiency. Pol central part is not limited to enzyme cutting site is not used to add, lack of sudden change Pol is made, PP binding energy is not currently discussed The high level of production of DNA fragments is determined by the presence of Pol fragments and the presence of PP fragments. Pol complex formation, Pol activity inactivation, C-terminal instability, Pol complex formation, Pol production reduction The stability of the system is very high, and the stability of the system is very low. In addition, unnecessary DNA parts are removed, and the amount of discovery is improved. The Pol activity, protein protein activity, complex formation energy, etc. were quantitatively evaluated.

项目成果

H.Kobayashi,K.Matsumoto,S.Misawa,K.Miura,H.Hirokawa: "An inhibitory effect of RGD peptide on protein-priming reaction of bacteriophages φ29 and M2" Mol.Gen.Genet.220. 8-11 (1989)

H. Kobayashi、K. Matsumoto、S. Misawa、K. Miura、H. Hirokawa：“RGD 肽对噬菌体 φ29 和 M2 的蛋白质引发反应的抑制作用”Mol.Gen.Genet.220（ 1989）

I.Kitabayashi,K.Matsumoto,H.Hirokawa: "Primer protein inhibits elongation activity of protein-priming DNA polymerase of bacteriophage M2" J.Biol.Chem.

I.Kitabayashi、K.Matsumoto、H.Hirokawa：“引物蛋白抑制噬菌体 M2 的蛋白引发 DNA 聚合酶的延伸活性”J.Biol.Chem。

K.Matsumoto,C.I.Kim,H.Kobayashi,H.Kanahiro,H.Hirokawa: "Aphidicolin-resistant DNA polymerase of bacteriophage φ29 APH^r71 mutant is hypersensitive to phosphonoacetic acid and butylphenyl-deoxyguanosine 5'triphosphate" Virology.

K. Matsumoto、C. I. Kim、H. Kobayashi、H. Kanahiro、H. Hirokawa：“噬菌体 φ29 APH^r71 突变体的 Aphidicolin 抗性 DNA 聚合酶对膦酰乙酸和丁基苯基脱氧鸟苷 5 三磷酸过敏”病毒学。

K.Matsumoto,H.Takano,C.I.Kim,H.Hirokawa: "Primary structure of bacteriophage M2 DNA polymerase:conserved segments within protein-priming DNA polymerases and DNA polymerase I of Escherichia coli" Gene. 84. 247-255 (1989)

K.Matsumoto、H.Takano、C.I.Kim、H.Hirokawa：“噬菌体 M2 DNA 聚合酶的一级结构：大肠杆菌的蛋白质引发 DNA 聚合酶和 DNA 聚合酶 I 内的保守片段”基因。

K.Matsumoto,A.Takeuchi,H.Hirokawa: "Predicting functional regions of bacteriophage M2 DNA polymerase" Jpn.J.Genet.64. 461 (1989)

K.Matsumoto、A.Takeuchi、H.Hirokawa：“预测噬菌体 M2 DNA 聚合酶的功能区域”Jpn.J.Genet.64。