マウスケラチノサイトの合成するVIII型コラ-ゲンcDNAのクロ-ニング

点击翻译按钮获取中文摘要

培養マウスケラチノサイト(10^8個)より塩酸グアニジン法を用いて、total RNA 約100μgを抽出した。さらにOligodTカラムによりpolyARNA 約10μgを単離した。Gubler and Hoffmanらの方法を用いてλgt11をベクタ-として(cDNAライブラリ-を作製した。ライブラリ-のスクリ-ニングの方法として(1)ケラチノサイトの合成する110kdのコラ-ゲンの抗体作製を試みた。ケラチノサイトにより110kdコラ-ゲンが活発に培養ミディアム画分に分泌されているのでミディアム画分よりDEAEクロマトグラフィ-などを用いて精製を試みたが微量のため抗原として使用できる程回収されなかった。次の方法として(2)合成オリゴヌクレオチドの作製を試みた。110kdコラ-ゲンを含む粗精製画分をSDSアクリルアミドゲル電気泳動後、Immobilon-Pにブロットし、110kdコラ-ゲンバンドを切り出し直接、Matsudairaの方法によりアミノ酸配列を決定することを試みた。しかしN末端がブロックされていたため決定不可能であった。さらに110kdコラ-ゲンをペプシン処理して得られる50kdについて同様の方法を用いて、アミノ酸配列決定を試みている。もしアミノ酸配列(少なくとも5-6残基)が決定できればこれに対応するオリゴヌクレオチド(あるいはそのmixture)を合成でき、これをプロ-ブとしてcDNAライブラリ-をスクリ-ニングできると思われる。