ヒト肥満細胞への発癌遺伝子導入による増殖反応への影響と細胞株樹立に関する研究

致癌基因导入人肥大细胞对增殖反应和细胞系建立的影响研究

• 批准号: 02670269
• 负责人: 田所 憲治
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02670269/
• 关键词: 肥満細胞; 鼻粘膜; 増殖; 細胞株; 発癌遺伝子; SV40; インタ-ロイキンー3; 線維芽細胞

1.ヒト肥満細胞の生化学的、機能的解析を目標に、ヒト肥満細胞に発癌遺伝子を導入し、その不死化、細胞株樹立について検討した。2.発癌遺伝子としては、精製したcーmyc、vーfes、cーrasの混合物、SV40 T antigenおよびψ2細胞(temperature sensitive SV40 T antigenを組み込んだplasーmidの産生細胞株)の培養上清を用いた。3.肥満細胞の分離:慢性副鼻腔炎患者の鼻粘膜、鼻ポリ-プをハザミで細切し、collagenase、hyaluronidaseで酵素処理し、nylon meshを通して、分離細胞を集めた。大多数の実験ではさらにpercoll分離法、抗ヒトlgE抗体結合DINA beadsによって肥満細胞を濃縮した。4.発癌遺伝子の導入:以下の3法によって数回ずつ遺伝子の導入を行った。(1)濃縮肥満細胞を3TS繊維芽細胞と混合培養し、肥満細胞が繊維芽細胞と接着した2日後に遺伝子混合物あるいはSV40 T antigenをmicroーinjection。(2)接着した肥満細胞を遺伝子混合物あるいはSV40 T antigenそして8μg/ml polybreneとともに6時間培養し10ー20%DMSOで4分間刺激。(3)分離鼻粘膜細胞、濃縮肥満細胞を50%のψ2細胞培養上清、1ー4μg/ml polybreneと共に2ー4時間incubationし、洗浄後、液体培養、3T3との混合培養、agar上のinterphase cultureを行った。いずれの場合も導入最中、導入後は培養液中に100ー500U/ml interleukinー3(ILー3)、500U/mlILー4、10%3T3培養上清を加えて培養した。5.培養液は2ー4日毎に半量交換し、肥満細胞はtoluidinーblue染色で検出した。6.結果:上記(3)の混合培養法で3ヵ月、(3)の液体培養法で1ヵ月余り肥満細胞を維持できたが、現在の所細胞株の樹立には至っていない。細胞株の樹立には静止期の細胞ではなく、それ自身に増殖力のある肥満細胞腫細胞等を用いる必要があると考えられ、手配中である。

1. Biochemical and functional analysis of human cells, introduction of cancer genes into human cells, and development of cell lines 2. Use of culture supernatant of SV40 T antigen and SV2 cells (temperature sensitive SV40 T antigen). 3. Isolation of fat cells: fine dissection, collagenase, hyaluronidase, enzyme treatment, nylon mesh, isolation of cells from nasal mucosa and nasal mucosa of patients with chronic paranasal sinusitis The majority of these cells are concentrated by percoll separation, anti-lgE antibodies combined with DINA beads. 4. Introduction of cancer gene: The following three methods are used to detect the introduction of cancer gene. (1)Concentrated cells, 3TS, micro-injection, micro-injection (2)Then the cells were incubated with SV40 T antigen at 8μg/ml polybrene for 6 minutes and stimulated with 10 - 20% DMSO for 4 minutes (3)Isolation of nasal mucosa cells, concentration of fertilizer cells, 50% of cell culture supernatant, 1 - 4μg/ml polybrene, 2 - 4 time incubation, washing, liquid culture, 3T3 mixed culture, agar on the interphase culture In some cases, 100 - 500U/ml interleukin-3(IL-3), 500 U/ml IL-4 and 10%3T3 culture supernatant were added to the culture medium after introduction. 5. The culture medium was exchanged every 2 to 4 days, and the cells were stained with toluidin blue. 6. Results: The mixed culture method mentioned above (3) was maintained for 3 months, and the liquid culture method (3) was maintained for more than 1 month, and all the cell lines were established now. The cell line is established in the quiescent stage of the cell, and its own proliferation is necessary for the cell to be used.