遺伝子工学の手法を用いた糖輸送担体の構造と機能の解析

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糖輸送担体の構造と機能の解析のため、GLUT1糖輸送担体のC末端細胞内部分の42個のアミノ酸の大部分、37個のアミノ酸が欠如した変異糖輸送担体のcDNAを作製し、これを発現ベクタ-pMTHneaに組み込み、カルシウム・リン酸沈殿法にてチャイニ-ズハムスタ-オバリ-(CHO)細胞に発現させた。大量の変異糖輸送担体の発現が細胞表面に認められたにもかかわらず、糖輸送活性の上昇はほとんど認められなかった。この糖輸送活性喪失の機構解析のため、種々のグルコ-スアナログを用いて検討したところ、糖輸送担体の細胞内側のグルコ-ス結合部位は障害を受けていないが、細胞外側のグルコ-ス結合部位に対しグルコ-スが結合できないと考えられた。このような機構の解析から、糖輸送担体は一種のグルコ-スの通り道を形成するチャンネルであり、外側と内側にゲ-トがあり、内部にグルコ-スを認識する結合部位があると考える。外側と内側のゲ-トが交互に開閉をし、外側のグルコ-スをはさみ込み、次いで細胞内部に放出するという「洗濯バサミ」様のモデルを提唱した。さらに、GLUT1の412位のトリプトファンをロイシンに置換した変異糖輸送担体cDNAを作製し、CHO細胞に発現させてその糖取り込み機構を解析した。この変異糖輸送担体の糖輸送活性は正常GLUT1の約15%であり、この解析から、412位のトリプトファンが内側のグルコ-ス結合部位、あるいはその極めて近傍に存在することが明らかとなった。