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ヒト染色体DNA複製開始を制御している遺伝子の単離と解析

控制人类染色体DNA复制起始的基因的分离和分析

基本信息

批准号：
05152075
负责人：
杉野明雄
金额：
$ 2.56万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05152075/
关键词：
染色体DNA複製開始 protein kinase 出芽酵母S.cerevisiae CDC7 DBF4 CDC7 homolog Northern hybridization 細胞周期

项目摘要

がん化の過程で重要と考えられる染色体DNA複製開始の調節に関する研究は殆ど進んでいない。その大きな理由の1つに高等動物細胞に於ける染色体DNA複製に関与する突然変異株がなかなか得られないところにある。一方単細胞であるが真核細胞の性質を備えている酵母は、遺伝学が非常に進んでいて、また容易に染色体DNA複製開始に関する突然変異株が得られる。また、最近の多くの研究から、生命にとって基本的な細胞周期、シグナル伝達やDNA複製の過程は酵母からヒト細胞に至るまで根本的に同じであることが明らかになりつつある。従って本研究は、酵母突然変異株を相補するヒト染色体DNA複製開始を制御している遺伝子の単離を試みた。出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)に於てG1からS期開始直前に必須な遺伝子としてセリン・スレオニン残基をリン酸化するprotein kinaseをコードしているCDC7が知られている。またCDC7 protein kinaseと複合体を形成し、protein kinaseを活性化しているDBF4遺伝子が知られている。そこでS.cerevisiae温度感受性突然変異株cdc7とdbf4を用いてヒト細胞よりCDC7とDBF4のhomologの単離を試みた。しかし残念ながらこの相補法では機能的に相同性のある遺伝子は現在まで得られていない。一方、CDC7 protein kinaseに特徴的なアミノ酸配列を基にして合成したoligonucleotidesをprimerを用いHeLa細胞より調整したmRNAをtemplateにしてPCR法によってDNA断片を増幅し、その塩基配列を決定した。この内の1つのDNA断片塩基配列より予想されるアミノ酸配列がS.cerevisiaeのCDC7のアミノ酸配列に非常に高い相同性を示した。従ってこの断片をprobeにして完全長のcDNAを単離した。このcDNAより予想されるアミノ酸配列はCDC7のアミノ酸配列と比較する全体で40%の相同性を示した。従ってこのcDNAはCDC7のヒトhomologをコードすると結論した。このcDNAをprobeにしたNorthern hybridization結果、予想通り、この遺伝子はG1とS期の間で発現していることが明らかになった。現在、この遺伝子産物に対する抗体を作製中であり、それを用いて今後この産物が本当にprotein kinaseであり、その活性がG1/S境界で上昇することを明らかにする予定である。

Research on the regulation of the initiation of chromosomal DNA replication is important in the process of DNA transformation. The reason for this is that higher animal cells are involved in chromosome DNA replication and sudden heterosis. The nature of a single cell is related to the preparation of yeast, DNA, and the initiation of chromosomal DNA replication. Recently, many studies have been conducted on the basic cell cycle, DNA replication and yeast replication. In this study, yeast mutant DNA replication was detected by DNA sequencing. The budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) is a protein kinase that must be activated before the start of the G1-S phase. CDC7 protein kinase complex formation, protein kinase activation, DBF4 protein synthesis S. cerevisae temperature sensitivity suddenly changed cdc7 to dbf4 in the middle of the cell, CDC7 to DBF4 in the middle of the cell. This is the first time I've ever seen a person who's been in a relationship with someone else. The gene sequence of CDC7 protein kinase was determined by PCR and DNA fragment amplification. The nucleotide sequence of the DNA fragment in this study was predicted to be very similar to that of S. cerevisia and CDC7. The cDNA fragment was isolated from the cDNA fragment. This cDNA sequence is expected to be 40% identical to the CDC7 sequence. The cDNA sequence of CDC7 was analyzed. The cDNA probe was detected by Northern hybridization, and the cDNA probe was detected in G1-S phase. Now, this protein product is in the process of antibody production, and the activity of this protein kinase is increasing in the future.