DNAポリメラーゼεミューテーター変異マウスの構築とその発がん機構の解析

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マウスDNA polymerase εをコードするPOLE1は約150kbにおよぶDNA断片上の49のexonに分かれている。現在までに、3'-5'exonuclease活性をコードするExo-I domainはExon9にあり、そのアミノ酸配列-FDIET-を-FAIAT-に変換したTarget Vector(pole1-exo1-)を作製した。また、出芽酵母DNA polymerase εのpol2C1O89Yに対応するアミノ酸配列はExon26にあり、そのアミノ酸配列-GLSCRYIIS-を-GLSYRIIS-に変換したTarget Vector(pole1-rsa)を作製した。最後に、出芽酵母pol2-16変異に相当するTarget Vector(pole1-Δcat)を作製した。こうして作製したTarget Vectorsを制限酵素で直線化し、マウスES細胞にトランスフォームし、G418及びDiphtheria toxinでセレクションしHetero置換体を同定、単離した。真の置換体であるかはLong PCR法、Southern法、及びDNA配列決定法を用いて検証した。一方、こうして同定、単離したマウスES細胞が3'-5'exonuclease活性を持たないDNA polymerase εを産生しているかどうかは現在検討中である。更に、確立したES細胞がミューテーターの表現型を示すかどうかをHTRP assay系等を用い測定する計画である。一方、出芽酵母を用い、3'-5'exonuclease活性をコードするExo-III domainに変異(SVSDAVATYYLYをSVSDAVHTYYLYに変換)を導入した自然突然変異を誘発する変異株を樹立した。