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DNAポリメラーゼεミューテーター変異マウスの構築とその発がん機構の解析

DNA聚合酶ε突变突变小鼠的构建及其致癌机制分析

基本信息

批准号：
17013056
负责人：
杉野明雄
金额：
$ 4.03万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17013056/
关键词：
DNAポリメラーゼε 遺伝学癌マウスES細胞ミューテーター

项目摘要

マウスDNA polymerase εをコードするPOLE1は約150kbにおよぶDNA断片上の49のexonに分かれている。現在までに、3'-5'exonuclease活性をコードするExo-I domainはExon9にあり、そのアミノ酸配列-FDIET-を-FAIAT-に変換したTarget Vector(pole1-exo1-)を作製した。また、出芽酵母DNA polymerase εのpol2C1O89Yに対応するアミノ酸配列はExon26にあり、そのアミノ酸配列-GLSCRYIIS-を-GLSYRIIS-に変換したTarget Vector(pole1-rsa)を作製した。最後に、出芽酵母pol2-16変異に相当するTarget Vector(pole1-Δcat)を作製した。こうして作製したTarget Vectorsを制限酵素で直線化し、マウスES細胞にトランスフォームし、G418及びDiphtheria toxinでセレクションしHetero置換体を同定、単離した。真の置換体であるかはLong PCR法、Southern法、及びDNA配列決定法を用いて検証した。一方、こうして同定、単離したマウスES細胞が3'-5'exonuclease活性を持たないDNA polymerase εを産生しているかどうかは現在検討中である。更に、確立したES細胞がミューテーターの表現型を示すかどうかをHTRP assay系等を用い測定する計画である。一方、出芽酵母を用い、3'-5'exonuclease活性をコードするExo-III domainに変異(SVSDAVATYYLYをSVSDAVHTYYLYに変換)を導入した自然突然変異を誘発する変異株を樹立した。

The DNA polymerase gene is about 150 kb long and the DNA fragment is about 49 kb long. Now, the 3'-5' exon activity is controlled by the Exo-I domain Exon9 and the Target Vector(pole1-exo1-) by FDIET-FAIAT-. The DNA polymerase ε of budding yeast pol2C1O89Y was mapped to the Target Vector(pole1-rsa). Finally, budding yeast pol2-16 is different from Target Vector(pole1-Δcat). Target Vectors are restricted enzymes that are linearized and isolated from ES cells, G418 and Diphtheria toxin. The true substitutions were identified by Long PCR, Southern, and DNA sequencing. The activity of 3'-5'exonuclease in ES cells was determined by DNA polymerase ε production. In addition, the phenotype of ES cells was determined by the HTRP assay. The activity of 3'-5'exonuclease in budding yeast was changed from SVSDAVATYYLY to SVSDAVHTYYLY.