DNAポリメラーゼεミューテーター変異マウスの構築とその発がん機構の解析

DNA聚合酶ε突变突变小鼠的构建及其致癌机制分析

基本信息

批准号：
17013056
负责人：
杉野明雄
金额：
$ 4.03万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17013056/
关键词：
DNAポリメラーゼε 遺伝学癌マウスES細胞ミューテーター

项目摘要

マウスDNA polymerase εをコードするPOLE1は約150kbにおよぶDNA断片上の49のexonに分かれている。現在までに、3'-5'exonuclease活性をコードするExo-I domainはExon9にあり、そのアミノ酸配列-FDIET-を-FAIAT-に変換したTarget Vector(pole1-exo1-)を作製した。また、出芽酵母DNA polymerase εのpol2C1O89Yに対応するアミノ酸配列はExon26にあり、そのアミノ酸配列-GLSCRYIIS-を-GLSYRIIS-に変換したTarget Vector(pole1-rsa)を作製した。最後に、出芽酵母pol2-16変異に相当するTarget Vector(pole1-Δcat)を作製した。こうして作製したTarget Vectorsを制限酵素で直線化し、マウスES細胞にトランスフォームし、G418及びDiphtheria toxinでセレクションしHetero置換体を同定、単離した。真の置換体であるかはLong PCR法、Southern法、及びDNA配列決定法を用いて検証した。一方、こうして同定、単離したマウスES細胞が3'-5'exonuclease活性を持たないDNA polymerase εを産生しているかどうかは現在検討中である。更に、確立したES細胞がミューテーターの表現型を示すかどうかをHTRP assay系等を用い測定する計画である。一方、出芽酵母を用い、3'-5'exonuclease活性をコードするExo-III domainに変異(SVSDAVATYYLYをSVSDAVHTYYLYに変換)を導入した自然突然変異を誘発する変異株を樹立した。

编码小鼠DNA聚合酶ε的极点1分为跨越约150 kb的DNA片段上的49个外显子。迄今为止，编码3'-5'Exonyclelease活性的EXO-I域在Exon9中发现，并且通过转换氨基酸序列-fdiet- to-faiat来产生目标矢量（POL1-EXO1-）。此外，在Exon26中发现了与萌芽酵母DNA聚合酶ε的POL2C1O89Y相对应的氨基酸序列，并且通过转换氨基酸序列-glscryiis-to-glsyriis--氨基酸序列-glscryiis-glsyriis-产生靶载体（POL1-RSA）。最后，制备了与糖酵母菌POL2-16突变相对应的靶向载体（极1-ΔCAT）。将其生产的靶向载体用限制酶进行线性化，转化为小鼠ES细胞，并使用G418和Diphtheria Toxin选择，以识别和分离异性替代。使用长PCR，南部和DNA测序方法验证了真正的替代方法。另一方面，目前正在研究中鉴定出的和隔离的小鼠ES细胞产生没有3'-5'Exonyclease活性的DNA聚合酶ε。此外，计划测量建立的ES细胞是否使用HTRP测定系统表现出突变器表型。另一方面，突变菌株诱导自发突变，其中将突变（将SVSDAVATYYLY转换为Svsdavhtyyly）引入了编码3'-5'Exonyareas活性的EXO-III III结构域。