真核生物染色体DNA複製開始反応に於けるCdc7-Dbf4リン酸化酵素の機能解析

Cdc7-Dbf4激酶在真核染色体DNA复制起始反应中的功能分析

基本信息

批准号：
03F00364
负责人：
杉野明雄
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00364/
关键词：
Cdc7 Dbf4 protein kinase Mcm2蛋白 Mcm2-7蛋白複合体 pre RC複合体 mcm2-12SA Mcm4蛋白 MALDI-Tof Mass Spectrometer 蛋白リン酸化

项目摘要

これまでの研究で、出芽酵母Cdc7/Dbf4 protein kinaseによるMcm2蛋白のリン酸化部位がMALDI-Tof Mass Spectrometerで決定された。そこで、本研究ではこれらのリン酸化されるセリン残基全てをアラニン残基に置換した変異遺伝子mcm2-12SAを構築した。こうして構築したmcm2-12SA蛋白を出芽酵母で多量発現させ精製し、この蛋白はもはやCdc7/Dbf4 protein kinaseの基質にならないことを確認した。一方、変異遺伝子をMCM2遺伝子と置き換え、複製開始反応に於ける影響を詳細に解析した。その結果、Cdc7/Dbf4 protein kinaseでリン酸化されないmcm2-12SA蛋白は野生株のMcm2蛋白と同様の複製開始機能を果たしていることを明らかにした。一方、精製したCdc7/Dbf4 protein kinaseとG1期に同調した出芽酵母細胞粗抽出液より調製したpre RC複合体と保温した。その結果、pre RC複合体の中のMcm2p及びMcm4pが定量的にリン酸化されることが明らかになった。しかし、Mcm4蛋白単独ではCdc7/Dbf4 proteinkinaseの基質にはならないことも明らかになった。これらの結果から、pre RC複合体中のMcm2蛋白はCdc7/Dbf4 protein kinaseの標的蛋白であることは間違いないが、そのリン酸化が複製開始反応に必須ではなく、むしろCdc7/Dbf4 protein kinaseがpre RC中のMcm2に結合し、他のMcm蛋白(例えば、Mcm4)をリン酸化することによって引き起こされるpre RCの構造変化が複製開始に重要であると結論づけられる。

在先前的研究中，使用MALDI-TOF质谱仪测定了发芽酵母CDC7/DBF4蛋白激酶MCM2蛋白的磷酸化位点。因此，在这项研究中，构建了突变基因MCM2-12SA，其中所有这些磷酸化的丝氨酸残基被丙氨酸残基代替。通过在萌芽的酵母中表达大量构建的MCM2-12SA蛋白是纯化的，并且已经证实该蛋白不再成为CDC7/DBF4蛋白激酶的底物。另一方面，将突变基因替换为MCM2基因，并详细分析了对复制起始反应的影响。结果，据表明，MCM2-12SA蛋白不会被Cdc7/DBF4蛋白激酶磷酸化，它作为野生菌株的MCM2蛋白具有相似的复制起始功能。同时，将PRC复合物与纯化的CDC7/DBF4蛋白激酶和从与G1相同步的发芽酵母细胞的粗提取物中孵育。结果，据揭示了RC复合物中的MCM2P和MCM4P被定量磷酸化。然而，也已经揭示了单独的MCM4蛋白不会成为CDC7/DBF4蛋白融合酶的底物。这些结果得出的结论是，尽管RC PRC复合物中的MCM2蛋白是CDC7/DBF4蛋白激酶的靶蛋白，但对于复制起始反应而言，这并不是必不可少的，而是由Cdc7/DBF4蛋白激酶在RC和phophostiation iSMMCM蛋白质中与MCM2结合的CDC7/DBF4蛋白激酶引起的RC的结构变化（EG）的重要性（EG）。