真核生物染色体DNA複製開始反応に於けるCdc7-Dbf4リン酸化酵素の機能解析

Cdc7-Dbf4激酶在真核染色体DNA复制起始反应中的功能分析

• 批准号: 03F00364
• 负责人: 杉野 明雄
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00364/
• 关键词: Cdc7; Dbf4 protein kinase; Mcm2蛋白; Mcm2-7蛋白複合体; pre RC複合体; mcm2-12SA; Mcm4蛋白; MALDI-Tof Mass Spectrometer; 蛋白リン酸化

これまでの研究で、出芽酵母Cdc7/Dbf4 protein kinaseによるMcm2蛋白のリン酸化部位がMALDI-Tof Mass Spectrometerで決定された。そこで、本研究ではこれらのリン酸化されるセリン残基全てをアラニン残基に置換した変異遺伝子mcm2-12SAを構築した。こうして構築したmcm2-12SA蛋白を出芽酵母で多量発現させ精製し、この蛋白はもはやCdc7/Dbf4 protein kinaseの基質にならないことを確認した。一方、変異遺伝子をMCM2遺伝子と置き換え、複製開始反応に於ける影響を詳細に解析した。その結果、Cdc7/Dbf4 protein kinaseでリン酸化されないmcm2-12SA蛋白は野生株のMcm2蛋白と同様の複製開始機能を果たしていることを明らかにした。一方、精製したCdc7/Dbf4 protein kinaseとG1期に同調した出芽酵母細胞粗抽出液より調製したpre RC複合体と保温した。その結果、pre RC複合体の中のMcm2p及びMcm4pが定量的にリン酸化されることが明らかになった。しかし、Mcm4蛋白単独ではCdc7/Dbf4 proteinkinaseの基質にはならないことも明らかになった。これらの結果から、pre RC複合体中のMcm2蛋白はCdc7/Dbf4 protein kinaseの標的蛋白であることは間違いないが、そのリン酸化が複製開始反応に必須ではなく、むしろCdc7/Dbf4 protein kinaseがpre RC中のMcm2に結合し、他のMcm蛋白(例えば、Mcm4)をリン酸化することによって引き起こされるpre RCの構造変化が複製開始に重要であると結論づけられる。

The MALDI-T of Mass Spectrometer was used to determine the position of Mcm2 protein in budding yeast Cdc7/Dbf4 protein kinase. In this study, we constructed a novel gene mcm2 - 12SA by replacing all the residues in the gene. To construct mcm2 -12SA protein budding yeast, the protein was purified and identified. One side, different transmission son MCM2 transmission son, change, copy start reverse transmission son, detailed analysis of the impact As a result, Cdc7/Dbf4 protein kinase was released from the wild strain Mcm2 -12SA protein and the replication of Mcm2 protein was initiated. A purified Cdc7/Dbf4 protein kinase is co-regulated in the G1 phase of the budding yeast cell extract. The results show that Mcm2p and Mcm4p in pre-RC complexes are quantitatively acidified. Mcm4 protein is isolated from Cdc7/Dbf4 protein. These results indicate that the Mcm2 protein in the pre-RC complex binds to the target protein of the Cdc7/Dbf4 protein kinase, and that the structural transformation of the pre-RC complex is important for the initiation of replication.