权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

真核生物染色体DNA複製フォークの分子ダイナミズム

真核染色体DNA复制叉的分子动力学

基本信息

批准号：
15107003
负责人：
杉野明雄
金额：
$ 61.15万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

1)出芽酵母染色体DNA複製開始前複合体(pre-RC)の形成反応(複製開始部位への逐次的なORC→Cdc6p→Cdt1p→Mcm2-7p複合体のLoading反応)をAFMを用い詳細に研究した。又、高度に精製した蛋白複合体を使って形成させたpre-RCにS-期に同調した出芽酵母細胞から調整した核粗抽出液を加え、試験管内において複製開始部位から特異的に開始するDNA複製反応系を確立した。2)出芽酵母染色体DNA複製に必須なGINS, RPA, Polεポロ酵素複合体とssDNAを鋳型として使って、Leading鎖合成反応を再構成し,詳細に解析した。3)アフリカツメガエル卵粗抽出液の染色体DNA複製反応に必要なGINS, Cut5,Polεホロ酵素複合体,Cdc45p等の蛋白複合体を精製し、GINS-Polεポロ酵素複合体,Cdc45p-Polεホロ酵素複合体,GINS-cdc45p-Cut5-Polεホロ酵素複合体形成反応を試験管内で再構成した。更に、Polεポロ酵素複合体を除去したアフリカツメガエル卵粗抽出液とDNAポリメラーゼ活性ドメインを持たないPolεホロ酵素複合体を用い、完全なPolεホロ酵素複合体が染色体複製反応に必須であることを証明した。4)前年度に同定したマウス5番染色体上に存在する複数の複製開始部位のより詳細な解析をPCR法とDNAマイクロアレイを使用して行った。5)出芽酵母染色体DNA複製開始に必須なCdc7-Dbf4複合体によるチェックポイント蛋白Rad53pのリン酸化による活性化機構を詳細に解析した。又、精製したRad53pが持つ一本鎖DNA部分に特異的に結合する反応を詳細に解析した。

1)AFM was used to study the formation of DNA pre-replication complex (pre-RC) in budding yeast. In addition, highly refined protein complexes were formed in pre-RC, S-phase homology was adjusted in budding yeast cells, and DNA replication reaction systems were established in the initial sites of replication in the test tubes. 2)DNA replication of budding yeast chromosomes requires GINS, RPA, Polε-enzyme complexes and ssDNA reconstitutions. 3) Purification of protein complexes such as GINS, Cut5,Polε-1 enzyme complex, Cdc45p, etc. from chromosomal DNA replication in crude egg extract, GINS-Polε-1 enzyme complex, Cdc45p-Pol ε-1 enzyme complex,GINS-cdc 45p-Cut5-Pol ε-1 enzyme complex formation reaction, and reconstruction in tube. In addition, the Polε-enzyme complex is removed from the crude extract of the egg and the DNA complex is activated. The Pol ε-enzyme complex is completely removed from the chromosome replication reaction. 4)A detailed analysis of the presence of multiple replication sites on the same chromosome in the previous year using PCR 5)Detailed analysis of Cdc7-Dbf4 complex, which is essential for initiation of DNA replication in budding yeast, and the mechanism for acidification of Rad 53p In addition, Rad53p was refined and analyzed in detail for the specific binding of a DNA fragment.