細胞刺激により放出される活性酸素の細胞内標的蛋白の同定とアミノ酸配列の決定

ヒト白血病細胞U937を^<35>S-メチオニンでラベル後、細胞毒性を示さない濃度(0.1mM)のH_20_2を処理し、全タンパク質の2次元電気泳道を行い、オートラジオグラフィーにより、ラベルされたタンパク質の解析を行った。未処理のものと比較して、ほとんどのタンパク質はH_20_2処理によりその量的変化を示さなかったが、3つの近接したスポットX、Y、Zが処理により消失することを見出した。次に、TPA処理により細胞から活性酸素が放出された時のこれらのタンパク質の変化を同様に検討したところ、X、Yは変化しなかったが、Zは、消失傾向を示し、その変化は、TPA処理と同時に活性酸素消去酵素、SOD、catalaseを加えておくこと抑制された。また、ヒト内皮細胞をTNFalphaで刺激した時にも細胞から活性酸素が放出されるが、この時にもスポットZは消失傾向を示した。以上の結果から、スポットZは、細胞刺激により放出される活性酸素の細胞内標的タンパク質と考えられた。スポットZの分子量は、約48kDa、pIは約6.7である。今後、2次元電気泳動により、このタンパク質500pMを分離精製後、トリプシンにてペプチドフラグメントに分解し、それをHPLCにて分離、マイクロシークエンサーによりアミノ酸配列を決定の予定である。アミノ酸配列が未知のものであったときには、決定アミノ酸配列をもとにオリゴヌクレオチドを合成し、cDNAライブラリーからPCRにてcDNAを単離、解析する予定である。

ヒト白血病細胞U937を^<35>S-メチオニンでラベル後、細胞毒性を示さない濃度(0.1mM)のH_20_2を処理し、全タンパク質の2次元電気泳道を行い、オートラジオグラフィーにより、ラベルされたタンパク質の解析を行った。未処理のものと比較して、ほとんどのタンパク質はH_20_2処理によりその量的変化を示さなかったが、3つの近接したスポットX、Y、Zが処理により消失することを見出した。次に、TPA処理により細胞から活性酸素が放出された時のこれらのタンパク質の変化を同様に検討したところ、X、Yは変化しなかったが、Zは、消失傾向を示し、その変化は、TPA処理と同時に活性酸素消去酵素、SOD、catalaseを加えておくこと抑制された。また、ヒト内皮細胞をTNFalphaで刺激した時にも細胞から活性酸素が放出されるが、この時にもスポットZは消失傾向を示した。以上の結果から、スポットZは、細胞刺激により放出される活性酸素の細胞内標的タンパク質と考えられた。スポットZの分子量は、約48kDa、pIは約6.7である。今後、2次元電気泳動により、このタンパク質500pMを分離精製後、トリプシンにてペプチドフラグメントに分解し、それをHPLCにて分離、マイクロシークエンサーによりアミノ酸配列を決定の予定である。アミノ酸配列が未知のものであったときには、決定アミノ酸配列をもとにオリゴヌクレオチドを合成し、cDNAライブラリーからPCRにてcDNAを単離、解析する予定である。