細胞刺激により放出される活性酸素の標的蛋白の同定とアミノ酸配列の決定

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我々は、外から加えた活性酸素及び、細胞から放出された活性酸素によって特異的に消失する蛋白質、spotz(分子量45KDa)を見い出し、その同定を目指している。SPOTZは^<35>S-メチオニンラベルにより2次元電気泳動ゲル上にオートラジオグラフィーによって見い出されたが、その後、クマシ-染色でも検出が可能であることを見い出し、その濃さから、2次元電気泳動ゲル1枚上に、0.1〜0.5μg存在すると予想された。アミノ酸のマイクロシークエンスには、500pmole以上の蛋白質が必要であり、現在までに2次元電気泳動ゲル50枚より、spotz部分を切り出し、集め終わった。今後、ゲルより一旦、蛋白質を抽出後、1次元SDSゲル電気泳動してニトロセルロース膜に転写、トリプシン消化したpeptideフラグメントをマイクロシークエンスの予定である。また、細胞をTriton-X-100で可溶化分画後、このspotzは、大部分、Triton可溶化画分に存在することがわかり、細胞膜、或は、細胞質に存在する蛋白質である可能性が高いと思われた。さらに、その存在量は、細胞の種類に依存し、マクロファージへの分化能を有するヒト白血病細胞V937には多く存在するが、ヒト繊維芽細胞、内皮細胞には少量であった。活性酸素(主に過酸化水素)に被曝後、消失に要する時間を調べたところ、外から一度に多量に加えた過酸化水素によっては、15分以内に速やかに消失し、TPA処理によって細胞自身からの活性酸素放出時には、約2時間を要した。以上の結果は、spotzが我々の想定する活性酸素センサーとなりうる性質を持っていることを示唆しており、今後、シークエンスをして同定を目指す予定である。