ヒト増殖細胞核抗原の構造と機能の解析

人增殖细胞核抗原结构与功能分析

基本信息

批准号：
06772121
负责人：
森岡弘志
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒト増殖細胞核抗原(PCNA)の構造-機能相関の解明を目的として、蛋白質工学的手法により作製したヒトPCNA変換体とRF-C(複製因子C)およびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べた。以下に、本研究によって得られた新たな知見等の成果を示す。1.T7RNAポリメラーゼ系を用いたヒトPCNA発現用プラスミドを構築し、大腸菌内でヒトPCNAを大量発現させた。各種カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、培養液1L当たり約30mgのPCNA蛋白質を得ることができた。2.PCR法を応用した部位特異的変異法により、ヒトPCNA遺伝子に変異を導入した。標的部位は生物間で高いホモロジーを示す29種の酸性または塩基性アミノ酸とし、これらをすべてアラニンに変換した。上記と同様の方法で、これらPCNA変換体を得た。3.RF-CおよびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べたところ、以下のことが示された。(1)C末端のLys254〜Glu259からなる領域はRF-CのATPase活性を促進するのに重要であった。(2)いくつかの酸性または塩基性アミノ酸はDNAポリメラーゼδのDNA合成活性の促進やRF-CのATPase活性の促進に関与していた。このうち9個所の塩基性アミノ酸残基(Lys13、Lys14、Lys20、Lys77、Lys80、Arg146、Arg149、Arg210、Lys217)は、予想されたリング状構造の内側のα-ヘリックス領域にほぼ一致しており、DNAと相互作用すると推定された。しかしながら、上記の活性が完全に失われたPCNA変換体を得ることはできなかった。すなわち、PCNAの複数のアミノ酸残基がDNAポリメラーゼδ、RF-CあるいはDNAと協同的に相互作用している可能性が考えられた。

为了阐明人类增殖核抗原（PCNA）的结构功能相关性，我们研究了通过蛋白质工程方法与RF-C（复制因子C）和DNA聚合酶δ产生的人PCNA转化器之间的相互作用。从这项研究中获得的新发现和其他结果的结果如下所示。 1。使用T7 RNA聚合酶系统进行人PCNA表达的质粒，并在大肠杆菌中表达了大量的人PCNA。使用各种色谱柱色谱法纯化结果，以获得每升培养基约30 mg PCNA蛋白。 2。通过使用PCR定向突变方法将突变引入人PCNA基因中。靶位点是29个酸性或碱性氨基酸，它们在生物体之间表现出很高的同源性，所有这些都转化为丙氨酸。这些PCNA转换器是通过与上述相同的方法获得的。 3。研究了与RF-C和DNA聚合酶δ的相互作用，并显示了以下内容。（1）由LYS254-GLU259组成的C末端区域对于促进RF-C的ATPase活性很重要。（2）几种酸性或碱性氨基酸参与促进DNA聚合酶δ的DNA合成活性和RF-C的ATPase活性。其中，有9种碱性氨基酸残基（Lys13，Lys14，Lys20，Lys77，Lys80，arg146，arg149，arg149，arg210和lys217）与预测的环形结构内的α-螺旋区域大致一致，并且估计与DNA相互作用。但是，无法获得上述活动完全丢失的PCNA转换器。也就是说，认为PCNA的多个氨基酸残基与DNA聚合酶δ，RF-C或DNA相互作用。