ヒト増殖細胞核抗原の構造と機能の解析

人增殖细胞核抗原结构与功能分析

• 批准号: 06772121
• 负责人: 森岡 弘志
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06772121/
• 关键词: 増殖細胞核抗原; 複製因子C; DNAポリメラーゼδ; 蛋白質工学; DNA複製; T7RNAポリメラーゼ

ヒト増殖細胞核抗原(PCNA)の構造-機能相関の解明を目的として、蛋白質工学的手法により作製したヒトPCNA変換体とRF-C(複製因子C)およびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べた。以下に、本研究によって得られた新たな知見等の成果を示す。1.T7RNAポリメラーゼ系を用いたヒトPCNA発現用プラスミドを構築し、大腸菌内でヒトPCNAを大量発現させた。各種カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、培養液1L当たり約30mgのPCNA蛋白質を得ることができた。2.PCR法を応用した部位特異的変異法により、ヒトPCNA遺伝子に変異を導入した。標的部位は生物間で高いホモロジーを示す29種の酸性または塩基性アミノ酸とし、これらをすべてアラニンに変換した。上記と同様の方法で、これらPCNA変換体を得た。3.RF-CおよびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べたところ、以下のことが示された。(1)C末端のLys254〜Glu259からなる領域はRF-CのATPase活性を促進するのに重要であった。(2)いくつかの酸性または塩基性アミノ酸はDNAポリメラーゼδのDNA合成活性の促進やRF-CのATPase活性の促進に関与していた。このうち9個所の塩基性アミノ酸残基(Lys13、Lys14、Lys20、Lys77、Lys80、Arg146、Arg149、Arg210、Lys217)は、予想されたリング状構造の内側のα-ヘリックス領域にほぼ一致しており、DNAと相互作用すると推定された。しかしながら、上記の活性が完全に失われたPCNA変換体を得ることはできなかった。すなわち、PCNAの複数のアミノ酸残基がDNAポリメラーゼδ、RF-CあるいはDNAと協同的に相互作用している可能性が考えられた。

ヒ ト raised colonization cell nucleus antigen (PCNA) の structure - function phase masato の interpret を purpose と し て, protein engineering technique に よ り cropping し た ヒ ト PCNA variations in body と RF - C (replicator C) お よ び DNA ポ リ メ ラ ー ゼ delta と の interaction を adjustable べ た. The following に, the られた new たな insights obtained from this study によって and other <s:1> results を show す. 1. T7RNA ポ リ メ ラ ー を ゼ department with い た ヒ ト PCNA 発 current プ ラ ス ミ ド を build し, coliform で ヒ ト PCNA を large 発 now さ せ た. Various カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を with い て refined し, 1 l culture when た り about 30 mg の PCNA protein を must る こ と が で き た. 2. The PCR method を応 uses the mutation method specific to the た site によ によ and ヒトPCNA remnant 伝 に mutation を to introduce the た. High mark parts は で between biological い ホ モ ロ ジ ー を す in 29 の acid ま た は salt basic ア ミ ノ acid と し, こ れ ら を す べ て ア ラ ニ ン に variations in し た. The above records と the same <s:1> method で and れら the PCNA variant を to get た. 3. The RF - C お よ び DNA ポ リ メ ラ ー ゼ delta と の interaction を adjustable べ た と こ ろ, the following の こ と が shown さ れ た. (1) C terminal の Lys254 ~ Glu259 か ら な る field は RF - C の ATPase activity を promote す る の に important で あ っ た. (2) い く つ か の acid ま た は salt basic ア ミ ノ acid は DNA ポ リ メ ラ ー ゼ delta の の promote DNA synthesis activity や RF - C の ATPase activity の promote に masato and し て い た. 9 こ の う ち の by salt basic ア ミ ノ acid residues (Lys13, Lys14, Lys20, Lys77, Lys80, Arg146, Arg149, Arg210, Lys217) は, to want to さ れ た リ ン グ structure の medial の alpha ヘ リ ッ ク ス field に ほ ぼ consistent し て お り, DNA と interactions Youdaoplaceholder0 presumed された. し か し な が ら, written の active が entirely に lost わ れ た PCNA variations in body を have る こ と は で き な か っ た. す な わ ち, PCNA の plural の ア ミ ノ acid residues が DNA ポ リ メ ラ ー ゼ delta, the RF - C あ る い は に interaction of DNA と し て い る possibility が exam え ら れ た.