ヒト増殖細胞核抗原の構造と機能の解析

人增殖细胞核抗原结构与功能分析

• 批准号: 06772121
• 负责人: 森岡 弘志
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06772121/
• 关键词: 増殖細胞核抗原; 複製因子C; DNAポリメラーゼδ; 蛋白質工学; DNA複製; T7RNAポリメラーゼ

ヒト増殖細胞核抗原(PCNA)の構造-機能相関の解明を目的として、蛋白質工学的手法により作製したヒトPCNA変換体とRF-C(複製因子C)およびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べた。以下に、本研究によって得られた新たな知見等の成果を示す。1.T7RNAポリメラーゼ系を用いたヒトPCNA発現用プラスミドを構築し、大腸菌内でヒトPCNAを大量発現させた。各種カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、培養液1L当たり約30mgのPCNA蛋白質を得ることができた。2.PCR法を応用した部位特異的変異法により、ヒトPCNA遺伝子に変異を導入した。標的部位は生物間で高いホモロジーを示す29種の酸性または塩基性アミノ酸とし、これらをすべてアラニンに変換した。上記と同様の方法で、これらPCNA変換体を得た。3.RF-CおよびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べたところ、以下のことが示された。(1)C末端のLys254〜Glu259からなる領域はRF-CのATPase活性を促進するのに重要であった。(2)いくつかの酸性または塩基性アミノ酸はDNAポリメラーゼδのDNA合成活性の促進やRF-CのATPase活性の促進に関与していた。このうち9個所の塩基性アミノ酸残基(Lys13、Lys14、Lys20、Lys77、Lys80、Arg146、Arg149、Arg210、Lys217)は、予想されたリング状構造の内側のα-ヘリックス領域にほぼ一致しており、DNAと相互作用すると推定された。しかしながら、上記の活性が完全に失われたPCNA変換体を得ることはできなかった。すなわち、PCNAの複数のアミノ酸残基がDNAポリメラーゼδ、RF-CあるいはDNAと協同的に相互作用している可能性が考えられた。

To clarify the structure-function relationship between PCNA and protein engineering methods, the interaction between PCNA and RF-C(replication factor C) is regulated. The results of this study are shown below. 1. T7 RNA RNA expression system was constructed and PCNA was expressed in large quantities in E. coli. A variety of culture media were used to refine, culture medium 1L when about 30mg PCNA protein was obtained. 2. PCR method is used for site-specific differentiation, and PCNA gene differentiation is introduced. The target site is located in the middle of the mountain. The above mentioned method is similar to that of PCNA. 3.RF-C and DNA interactions are regulated by the following: (1)C The terminal region Lys254 ~ Glu259 plays an important role in promoting RF-C ATPase activity. (2)DNA synthesis activity and RF-C ATPase activity are related to the promotion of DNA synthesis activity and RF-C ATPase activity. The nine basic amino acid residues (Lys13, Lys14, Lys20, Lys77, Lys80, Arg146, Arg149, Arg210, Lys217) were predicted to be the same as those in the α-domain of the inner structure of the protein. The activity of PCNA is completely lost. The possibility of DNA interaction between multiple acid residues of PCNA and RF-C is examined.