修飾オリゴヌクレオチドを用いた紫外線損傷DNA修復機構の解析

使用修饰寡核苷酸分析紫外线损伤的 DNA 修复机制

• 批准号: 06263201
• 负责人: 森岡 弘志
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06263201/
• 关键词: 紫外線損傷DNA; チミンダイマー; T4エンドヌクレアーゼV; メチルホスホネート; オリゴヌクレオチド

以下に、今年度得られた新たな知見等の成果を示す。(1)チミンダイマーのヌクレオシド間のリン酸残基をメチルホスホネートに修飾したオリゴヌクレオチド(d(GCACGT[pMe]TGCACG、T[pMe]T:メチルホスホネート結合を有するチミンダイマー誘導体)を化学合成し、高速液体クロマトグラフィーで分離精製した。なお、合成の際に生じるチミンダイマー間のリン酸結合の2種類のジアステレオマ-(Rpメチルホスホネート体およびSpメチルホスホネート体)をそれぞれ分離同定した。相補鎖とハイブリダイズさせて2本鎖とした後、合成遺伝子を大腸菌内で発現させ精製されたT4エンドヌクレアーゼVを用いて、フィルターバインディング法により酵素-基質複合体の解離定数を求めた。その結果、通常のチミンダイマーを含む基質を用いた場合には2.0×10^<-8>M、Spメチルホスホネート体では1.6×10^<-7>M、Rpメチルホスホネート体では結合がみられなかった。また、酵素による基質の切断反応を調べたところ、Spメチルホスホネート体では切断が見られたのに対して、Rpメチルホスホネート体では切断はみられなかった。すなわち、(i)チミンダイマー部分のリン酸基に存在する酵素原子が酵素と相互作用していること、(ii)T4エンドヌクレアーゼVは基質DNA中のチミンダイマー部位に対してマイナ-グルーブ側から結合していることが明らかにされた。この解析結果は、既に得られているメチル化保護法の結果と一致した。(2)(6-4)光産物を含むオリゴヌクレオチド(d(CAAT[6-4]TAAG)、T[6-4]T:(6-4)光産物)を合成した。さらに、T4DNAリガーゼにより結合させ、鎖長28および57の2本鎖DNAを作製した。また、チミンダイマー、(6-4)光産物等のDNA損傷を特異的に認識する数種のモノクローナル抗体の可変領域部のcDNAをクローニングした。

The following に, the られた new たな insights obtained this year, and other <s:1> achievements を show す. (1) チ ミ ン ダ イ マ ー の ヌ ク レ オ シ ド between の リ ン acid residues を メ チ ル ホ ス ホ ネ ー ト に modified し た オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド (d (GCACGT pMe TGCACG, T (pMe) T: メ チ ル ホ ス ホ ネ ー ト combining を have す る チ ミ ン ダ イ マ ー inductor) を chemical synthesis し, high-speed liquid ク ロ マ ト グ ラ Youdaoplaceholder0 フィ で separate and refine た. Born な お, synthetic の interstate に じ る チ ミ ン ダ イ マ ー between の リ ン acid combined with の 2 kinds の ジ ア ス テ レ オ マ - (Rp メ チ ル ホ ス ホ ネ ー ト body お よ び Sp メ チ ル ホ ス ホ ネ ー ト) を そ れ ぞ れ separation with fixed し た. Fill phase lock と ハ イ ブ リ ダ イ ズ さ せ て 2 this lock と し た within, synthetic but 伝 を coliform で 発 now さ せ refined さ れ た T4 エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ V を with い て, フ ィ ル タ ー バ イ ン デ ィ ン グ method に よ り enzyme - matrix composite の dissociation constant を o め た. そ の results, usually の チ ミ ン ダ イ マ ー を containing を む matrix with い た occasions に は 2.0 * 10 ^ < - > 8 M, Sp メ チ ル ホ ス ホ ネ ー ト body で は 1.6 * 10 ^ 7 < - > M, Rp メ チ ル ホ ス ホ ネ ー ト body で は combining が み ら れ な か っ た. ま た, enzyme に よ る matrix の cut off against 応 を adjustable べ た と こ ろ, Sp メ チ ル ホ ス ホ ネ ー ト body で は cut が see ら れ た の に し seaborne て, Rp メ チ ル ホ ス ホ ネ ー ト body で は cut は み ら れ な か っ た. す な わ ち, (I) チ ミ ン ダ イ マ ー part の リ ン acid radical に exist す る enzyme が enzyme と atomic interaction し て い る こ と, (ii) T4 エ ン ド ヌ ク レ ア ー ゼ V は substrate DNA の チ ミ ン ダ イ マ ー parts に し seaborne て マ イ ナ - グ ル ー ブ side か ら combining し て い る こ と が Ming ら か に さ れ た. The result of the <s:1> <s:1> analysis is, which is に. The られて るメチ るメチ and the と results of the られて protection law are consistent with each other. Youdaoplaceholder5 た. (2) (6-4) light product contains を む オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド (d (CAAT TAAG) 6 - [4], T [6-4] T: (6-4) light product) を synthetic し た. Youdaoplaceholder0, T4DNAリガ リガ ゼによ ゼによ さらに combined with させ and two lock-length 28および57 <s:1> lock-length DNAを to prepare た. ま た, チ ミ ン ダ イ マ ー, (6-4) light products such as DNA damage の を specific に know す る several の モ ノ ク ロ ー ナ の ル antibody can be - field of の cDNA を ク ロ ー ニ ン グ し た.