増殖細胞核抗原(PCNA)が関与するDNA修復の分子機構の解析

增殖细胞核抗原（PCNA）DNA修复的分子机制分析

• 批准号: 09771959
• 负责人: 森岡 弘志
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771959/
• 关键词: 増殖細胞核抗原; PCNA; DNA修復; FEN-1; 部位特異的変異; GADD45

PCNAは,真核細胞のDNA複製に関与するDNAポリメラーゼδ(polδ)のprocessive DNA合成に必須の補助因子であり,複製因子C(RFC)のDNA依存性ATPase活性を促進することが知られている.また,紫外線照射により損傷を受けたプラスミドを鋳型とした無細胞ヌクレオチド除去修復系による実験から,ヌクレオチド除去修復因子の1つとしても示唆されている.さらに,サイクリン依存性キナーゼの阻害因子であるp21やGADD45,DNA複製および修復の両方に関与するFEN-1等に結合することが報告される等,PCNAはDNA上で起こる各種反応の制御機構に重要な役割を果たしていると考えられている.本研究の代表者は,PCNAが関与するDNA修復の分子機構の解明を目的として,組換え型ヒトPCNA変換体を用いて,特にFEN-1との相互作用の解析を行っている.以下に,今年度得られた新たな知見等の成果を示す.PCNAの21番目のアスパラギン酸をアラニンに変換した変異体ではRF-cの.ATPase活性促進およびPolδのDNA鎖伸長反応促進は野生型PCNAと同様であったがFEN-1のエンドヌクレアーゼ活性促進は野生型PCNAに対し20〜40%まで低下していた.そこで,21番目のアスパラギン酸をグルタミン酸(D21E)またはアスパラギン(D21N)に変換した変異体を作製し,FEN-1のエンドヌクレアーゼ活性促進能を調べたところ,D21Eでは野生型と同等の活性促進能を示したが,D21Nでは野生型の10〜30%しか活性促進能がみられなかった.以上のことから,FEN-1のエンドヌクレアー活性促進にはPCNAの21番目のアスパラギン酸の負電荷が重要と考えられた.

PCNA is an essential helper factor for DNA replication in eukaryotes, and promotes replication factor C(RFC) and DNA-dependent ATPase activity. In addition, UV irradiation can cause damage to the cells, and can cause damage to the cells. In addition,PCNA is responsible for DNA replication and repair, and for the regulation of various reactions on DNA. The authors of this study aim to elucidate the molecular mechanisms involved in DNA repair by PCNA, especially the interaction between PCNA and FEN-1. The results of this study are shown below. PCNA 21-segment DNA loss rate is reduced by 20 ~ 40%.ATPase activity is promoted by Pol delta DNA lock elongation and is promoted by Pol delta DNA lock elongation. FEN-1 has the same activity promotion energy as wild-type FEN-1, and D21E has the same activity promotion energy as wild-type FEN-1, and D21N has the same activity promotion energy as wild-type FEN-1, and D21N has the same activity promotion energy as wild-type FEN-1. The negative charge of FEN-1 is important for the enhancement of PCNA activity.

项目成果

Morioka,H.: "Antibodies specific for (6-4) DNA photoproducts: Cloning,antibody modeling and construction of a single-chain Fv derivative." Biochim.Biophys.Acta. 1385. 17-32 (1998)

Morioka, H.：“(6-4) DNA 光产物特异性抗体：单链 Fv 衍生物的克隆、抗体建模和构建。”

Kobayashi, H.: "Effects of a high-affinty antibody fragment on DNA polymerase reactions near a (6-4) photoproduct site"Photochem. Photobiol.. 69. 226-230 (1999)

Kobayashi, H.：“高亲和力抗体片段对 (6-4) 光产物位点附近 DNA 聚合酶反应的影响”Photochem。

Kobayashi,H.: "Probing the Interaction between a high-affinity single-chain Fv and pyrimidine (6-4) pyrimidone photodimer by site-directed mutagenesis." Biochemistry. 38. 532-539 (1999)

Kobayashi,H.：“通过定点诱变探索高亲和力单链 Fv 和嘧啶 (6-4) 嘧啶酮光二聚体之间的相互作用。”

Kobayashi,H.: "The role of surface lysines in pyrimidine(6-4)pyrimidone photoproduct binding by a high-affinity antibody." Protein Eng.11. 1089-1092 (1998)

Kobayashi,H.：“表面赖氨酸在高亲和力抗体与嘧啶 (6-4) 嘧啶酮光产物结合中的作用。”

Hiroshi Morioka: "Antibodies specific for(6-4)DNA phtoproducts:Cloning,antibody modeling and construction of a single-chain Fv derivative." Biochim.Biophys.Acta. (in press.).

Hiroshi Morioka：“(6-4)DNA 光产物特异性抗体：单链 Fv 衍生物的克隆、抗体建模和构建。”